核仁小RNA：腫瘤及其他多種疾病的新型分子標志物*

孫潔璇，高 卓 綜述，姜曉峰 審校

哈爾濱醫科大學附屬第四醫院檢驗科,黑龍江哈爾濱 150028

隨著新一代測序技術和生物信息學技術的發展，人們對多種疾病致病及易感基因的了解越來越深入，而非編碼RNA(ncRNA)家族無疑是近年來分子生物學領域研究的熱點，其在多水平調控著疾病進程中關鍵基因的表達。ncRNA家族成員可分為兩種主要類型：基礎結構型和調控型。從表觀遺傳學的角度來看，調控型ncRNA更受關注。核仁小RNA(snoRNA)長度為60～300個核苷酸，在脊椎動物中大多數由內含子區編碼產生，每個內含子編碼產生的snoRNA不超過1個[1]，因此snoRNA是ncRNA家族中最具特征的一類。snoRNA的傳統功能被認為是參與核糖體RNA(rRNA)轉錄過程中假尿苷化和2′-甲基化修飾。已有研究表明，在黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤及其他多種疾病中，snoRNA都存在異常表達，且發揮著重要的調控作用[2-6]。此外，snoRNA在血清標本中可以穩定存在且更易于檢測[7]。因此，snoRNA有望作為腫瘤及其他多種疾病早期診斷、療效檢測、預后評估的潛在分子生物學標志物[7]，并可能為藥物治療提供新的靶點。

1 snoRNA基礎結構及生物學功能

snoRNA主要定位于核仁或Cajal小體，根據保守序列的結構不同主要分為Box C/D和Box H/ACA兩個家族[8]。Box C/D snoRNA存在兩個短的保守序列，分別位于5′和3′末端附近的C盒(UGAUGA)和D盒(CUGA)，而Box H/ACA snoRNA則是共有的發夾-鉸鏈-發夾-尾巴結構，該結構在鉸鏈區(ANANNA，其中N是任意核苷酸)中包含1個保守序列H盒，并在其中包含1個ACA盒分別形成C型和發夾型結構。snoRNA必須與相應蛋白復合物結合形成核仁小核糖核蛋白復合體(snoRNP)以便于開啟后期功能。Box C/D snoRNA與4個必需纖維蛋白(Nop1p、Nop56p、Nop58p和15.5-kDa/Snu13)結合形成snoRNP，指導其RNA靶標的2′-O-核糖甲基化。而Box H/ACA snoRNA則可與蛋白質Cbf5、Nop10、L7Ae和Gar1結合形成snoRNP，指導RNA靶標假尿苷化[9]。最近還發現了不以堿基配對的方式識別靶向序列的Box C/D snoRNA，稱為孤兒snoRNA[10]。

除了基礎的修飾外，snoRNA可能是細胞代謝、應激反應的關鍵介質。MICHEL等[11]發現,在棕櫚酸酯誘導的氧化應激模型中，3種snoRNA(SNORD32A、SNORD33、SNORD35A)的缺失會使細胞免受脂肪毒性，而在經脂多糖處理的小鼠肝組織中，SNORD32A、SNORD33、SNORD35A的表達顯著上調。此外，在缺氧條件下SNORD14A和SNORD83B的表達顯著上調[12]。雖然snoRNA主要參與RNA轉錄過程的修飾，但是研究發現snoRNA可以像微小RNA(miRNA)一樣發揮功能，是某些miRNA的前體。ENDER等[13]發現,snoRNA ACA45衍生出20～22個核苷酸的RNA能夠抑制靶基因CDC2L6的表達，類似于miRNA。此外，YIN等[14]發現，在HeLa細胞和人類胚胎干細胞中存在長鏈非編碼RNA(LncRNA)，LncRNA兩個末端各包含1個snoRNA序列。還有研究發現，SNORD50A過表達或缺失都會影響信使RNA(mRNA)3′端的加工效率，說明snoRNA在mRNA 3′端加工中起到重要的調節作用[15]。

2 snoRNA與腫瘤

2.1snoRNA與腫瘤的早期診斷 早期有效診斷可明顯延長腫瘤患者的生存期，腫瘤發現的早晚決定了患者的治療方式和預后。snoRNA與腫瘤的發生、發展密切相關，在血液標本中以高豐度穩定存在，擁有早期診斷類分子標志物的基本特質，具備作為大范圍體檢指標的潛力。MEI等[16]發現，SNORA42在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中高表達，并可以促進人類NSCLC細胞的增殖及小鼠體內NSCLC組織的生長，起到癌基因的作用。LIAO[7]等對NSCLC患者NSCLC組織與正常組織的研究發現，高表達于NSCLC組織的snoRNA(SNORD33、SNORD66和SNORD76)聯合診斷NSCLC的靈敏度為83.8%，特異度為96.2%。SNORD76不僅在NSCLC中高表達，還在肝細胞癌中高表達。WU等[17]通過受試者工作特征曲線驗證了SNORD76在肝細胞癌早期診斷中有較高的應用價值(曲線下面積為0.73)。有研究發現，在人類前列腺癌組織中高表達SNORA55，沉默該基因的表達可抑制前列腺癌細胞的增殖和轉移[18]。ZHU等[19]研究發現，過表達SNORD89可導致卵巢癌細胞停滯在細胞周期的S期，使卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力增強。可見，snoRNA可以成為腫瘤診斷的一類新的分子標志物。

2.2snoRNA與腫瘤的預后 snoRNA不僅能夠影響腫瘤的發生、發展，其對腫瘤的不良預后也有一定提示作用。SUN等[20]發現，SNORA7B在乳腺癌中起到致癌基因的作用，SNORA7B的表達與癌灶大小和淋巴結轉移呈正相關，并且高表達SNORA7B的乳腺癌患者總體生存率明顯降低。SNORA7B可以為乳腺癌患者提供準確的預后評估。HE等[21]研究發現，SNORD16在結腸癌組織中表達明顯上調，高、低SNORD16表達組患者的5年生存率分別為56.0%和78.4%。與癌旁組織相比，肝細胞癌組織中SNORD78表達上調，并且SNORD78的高表達會導致患者總生存期及無復發生存期縮短[22]。SNORD78也與NSCLC的預后不良有關，SNORD78高表達患者的預后明顯差于低表達患者[23]。此外，多種snoRNA聯合檢測對腫瘤預后不良有更高的預測價值，例如在胃癌中高表達的8種snoRNA(ACA47、E2、ACA10、SNORA58、HBII-316、U70、U8和U66)[24]，在頭頸部鱗狀細胞癌中高表達的5種snoRNA(SNORD114-17、SNORA36B、SNORD78、U3chr2及U3chr17)[25]，在腎透明細胞癌中高表達的6種snoRNA(SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93和SNORD116-2)[26]，以及在NSCLC中高表達的6種snoRNA(SNORA47、SNORA68、SNORA78、SNORA21、SNORD28和SNORD66)[27]。

2.3snoRNA作為腫瘤的治療靶點 沉默snoRNA介導的轉錄途徑是腫瘤的治療靶點。XU等[28]發現，SNORD47在體內和體外都可以顯著抑制神經膠質瘤細胞的生長和增殖。雖然替莫唑胺作為治療膠質母細胞瘤的一線化療藥物，但其耐藥性限制了治療效果，而SNORD47在抑制體內腫瘤生長方面與替莫唑胺具有協同作用。此外，SNORD76在肝細胞癌中表達水平明顯增高，其通過誘導G0/G1期細胞而發揮作用，為治療肝細胞癌提供了潛在的靶點[17]。SNORA21在結直腸癌中過表達，其通過調控S期細胞促進腫瘤浸潤，這可能成為結直腸癌的潛在治療靶點[29]。CUI等[30]發現，SNORA23僅在胰腺導管腺癌組織中表達，在非胰腺導管腺癌組織中未檢測到，并且在胰腺導管腺癌細胞中SNORA23的表達水平與侵襲能力呈正相關，與患者無病生存期呈負相關；在小鼠體內發現抑制SNORA23的表達可抑制腫瘤的形成，為胰腺導管腺癌提供了一個新的治療靶點。

2.4snoRNA參與腫瘤的病理過程 隨著對snoRNA研究的不斷深入，QIN等[31]發現，沉默SNORA74B可通過誘導PH域富含亮氨酸重復蛋白磷酸酶(PHLPP)基因表達及抑制蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路來抑制膽囊癌細胞的增殖。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路異常激活是引起肺癌的機制之一[32]。TANG等[33]發現,抑制SNORA71A表達后，MAPK/ERK信號通路中的ERK1/2磷酸化水平也會被抑制。此外，胞內磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號通路的異常激活也是引起腫瘤的機制之一，在肝細胞癌中高表達的snoRNA ACA11和SNORD126都是通過激活PI3K/AKT信號通路來促進肝細胞癌增殖、遷移和侵襲[34-35]。WANG等[36]發現，敲除在肝細胞癌中高表達的SNOU2-19可以誘導細胞質內β-連環蛋白(β-catenin)易位，抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而影響癌細胞的增殖。上皮間質轉化(EMT)是腫瘤細胞侵襲和轉移的重要標志，也是浸潤性癌的特征之一[37]，SNORD76通過誘導EMT促進肝細胞癌的侵襲[17]，SNORD47通過誘導EMT促進肝細胞癌的發生[38]。

3 snoRNA與其他疾病

3.1遺傳性疾病 普拉德-威利綜合征(PWS)是一種父源染色體15q11.2-q13區域印記基因功能缺陷所導致的遺傳性疾病，其臨床表現主要為認知障礙、發育遲緩、睡眠異常和導致肥胖的暴飲、暴食。研究發現，在小鼠PWS模型中SNORD116的缺失更容易出現出生后體質量低、身材矮小、骨量減少、貪食和能量消耗改變[6]，而SNORD115則與各種心理和行為變化(如自閉癥)有關[5]。

3.2自身免疫性疾病 系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種以細胞免疫和體液免疫功能障礙為特征，并介導組織器官損傷的自身免疫性疾病，其主要發病機制是T和B淋巴細胞的高度活化和功能異常。LAI等[4]發現，SLE患者T淋巴細胞中SNORA12的表達水平降低，并且其表達水平與SLE疾病活動度評分呈負相關。SNORA12表達水平的升高明顯抑制了干擾素(IFN)-γ的分泌，而IFN-γ是一種關鍵的促炎細胞因子，其在SLE患者的血清中水平升高，提示SNORA12表達水平降低可能通過使SLE患者T淋巴細胞和IFN-γ分泌增加，促進SLE的發病。

3.3血液系統疾病 在原發性急性髓細胞白血病(AML)中最常見的染色體易位是t(8;21)，而這種易位產生的融合基因AML1-ETO可發揮特異性癌基因的作用，增強造血干細胞的自我更新能力。ZHOU等[3]發現，AML1-ETO誘導自我更新的關鍵機制就是使rRNA 2′-O-甲基化的Box C/D snoRNP增加，而該途徑也可能成為AML潛在的治療靶點。

4 snoRNA檢測方法

snoRNA具有作為腫瘤及其他多種疾病早期診斷、預后評估的生物標志物的潛力，如何準確檢測snoRNA的表達水平也是當前研究的熱點之一。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是目前應用最廣泛也是最便捷的snoRNA檢測方法之一，主要包括TaqMan探針法和熒光染料法。TaqMan探針法的優點在于減少工作量，但需要根據序列合成不同的探針，成本也相對較高。熒光染料法雖然成本較低，但可能會產生非特異性產物，出現假陽性信號，影響檢測結果。數字PCR(dPCR)是一種不需要依賴標準曲線的核酸絕對定量技術。有研究發現，dPCR對抑制物(乙二胺四乙酸、肝素等)的耐受程度比RT-qPCR高，出現假陰性的概率相對較低、靈敏度較高[39]。高通量測序在snoRNA檢測方面具有數據量大、拓展性強的優勢，但同時也存在局限性。由于高度同源區域的存在會使高通量測序的覆蓋范圍不足而出現假陰性結果，也會產生交叉反應導致假陽性結果，而致病性突變基因的捕獲效率也會受GC含量的影響，可能出現假陰性結果。此外，測序能力取決于同時包含過濾陰性基因和標注陽性基因的全面性數據庫，而目前也亟需具有國際性標準的數據庫[40]。

5 snoRNA相關數據庫

為了更方便快捷地研究snoRNA，目前已建立了多個相關數據庫。有主要針對snoRNA基本結構、序列的數據庫，例如：snoRNA-LBME-db、sno/scaRNAbase數據庫等；還有為了方便查詢snoRNA基因座中核苷酸變異位點的數據庫snoLOVD；還有更傾向于snoRNA在腫瘤方面相關研究的數據庫SNORic，其可以查詢snoRNA在腫瘤中的表達情況、生存曲線分析，以及基因的相關性分析等信息。而數據庫snoDB則整合了上述幾個數據庫的基因相關信息和多種功能，可以查詢到更全面的信息。

6 小結與展望

綜上所述，snoRNA與腫瘤及其他多種疾病的發生、發展密切相關。目前可以在血清、腫瘤組織等臨床標本中檢測snoRNA，適于臨床開展。snoRNA在腫瘤的早期診斷、預后判斷等方面具有較大的潛力，甚至可以通過沉默其表達作為惡性腫瘤的潛在治療靶點，從而有效提高腫瘤患者的生存率。