MMP-2在糖尿病視網膜病變中的作用

王寧，李志堅，劉平，蘇勝

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科醫院三病房，哈爾濱 150001)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病重要的眼部并發癥。首次診斷出糖尿病時，約15%的患者患有一定程度的DR，且大多數患者將在20年后出現這種微血管并發癥。這一并發癥是勞動年齡(20～65歲)人群視力下降的主要原因。雖然DR不是一種致命性疾病，但會造成患者心理上的困擾、降低日常生活能力，從而顯著影響其生活質量[1]。DR的早期診斷可以預防或延緩視力喪失并減少相關治療成本，然而DR早期無癥狀，通常發展到晚期才被發現，因此治療的有效性大大降低。目前，DR的治療策略旨在控制微血管并發癥，包括玻璃體內注射藥物、激光光凝和玻璃體手術。但現有的治療方法存在一定的局限性，如治療周期長、費用昂貴以及治療效果欠佳。因此，尋找新的、有效的治療藥物迫在眉睫。

微血管細胞損害是DR的早期病理改變，而視網膜缺血缺氧引起新生血管出現則是DR增殖期的重要標志。在DR的發病機制中，視網膜毛細血管細胞(周細胞和內皮細胞)的氧化應激——線粒體功能障礙和凋亡早于微血管組織病理學特征出現[2]，提示早期細胞凋亡加速可以引發微血管結構受損。而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2參與細胞凋亡及新生血管產生的過程[3]，因此MMP-2可能被高糖環境激活進而參與DR的發生和發展。現就MMP-2在DR中的作用予以綜述，以開發出新的治療藥物早期干預DR的發生或減緩疾病的發展。

1 MMP-2的生物學特性

MMP是鋅和鈣依賴性內肽酶，根據MMP是分泌到細胞外基質還是錨定在細胞表面分為分泌型和膜結合型兩種。而根據優先選擇的底物MMP可以分為5類：膠原酶(MMP-1、8、13、18)，明膠酶(MMP-2、9)，溶血素(MMP-3、10、11)，膜型MMP(MMP-14、15、16、17、24、25)和其他(MMP-7、12、19、20、21、22、23)[3]。MMP的一級結構各不相同，但它們均與活性部位的鋅離子、信號肽和丙肽共享一個保守的催化結構域。除基質溶血素和MMP-23外，大多數MMP均有一個血紅素樣結構域，該結構域在底物識別、誘導自身活化以及與抑制劑和細胞表面受體結合方面發揮重要作用[4]。MMP的活性受內源性組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)調節。

MMP-2是分泌到細胞外基質的明膠酶，其分解Ⅳ型膠原，保持基質的合成和降解平衡。而在未激活時，MMP-2表達為無活性的酶原形式(ProMMP-2)。ProMMP-2丙肽中的自由鋅連接硫醇基，以保持酶原的穩定，直到通過“半胱氨酸開關”激活[5]。MMP-2與骨關節[6]、心臟、眼等部位疾病和腫瘤的發生有關。基于MMP-2的蛋白水解活性，其在細胞增殖、侵襲和凋亡以及細胞外基質產生與降解的平衡等過程中發揮重要作用。此外，活化的MMP-2還可以通過促進新生血管的形成和調節細胞間黏附等過程促進腫瘤的侵襲和轉移[7]。Wang等[8]發現，主動脈瓣二瓣化患者的血漿MMP-2表達水平異常升高，其破壞包括彈性纖維和膠原纖維在內的細胞外基質各種成分，且升主動脈內皮細胞凋亡亦增多，導致升主動脈體積增大和彈性功能受損，最終導致動脈重構。同時，MMP-2還能使老年主動脈瓣細胞凋亡明顯增多，分解明膠活性增強，降解細胞外基質和基膜成分，降解產物的聚集使得瓣膜增厚，鈣鹽易于沉積。另有研究顯示，MMP-2的激活參與了DR的發病[9]。

2 MMP-2參與DR發生發展的調控機制

DR的進展與視網膜微脈管系統異常有關，包括血視網膜屏障通透性增加，血管內皮細胞和周細胞丟失，血管基膜增厚，毛細血管閉塞，視網膜神經元和神經膠質異常增生以及新生血管生成[1]。MMP-2在DR的發展中起雙重作用。在早期階段(新生血管發生之前)，MMP可能具有細胞內作用，它們促進視網膜毛細血管細胞凋亡，導致周細胞和內皮細胞喪失，這是早期DR的特征[10-11]。然而在疾病后期，MMP可能起到細胞外蛋白酶的作用，從而促進新生血管在增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)中的發展[12]。

2.1早期介導線粒體損傷-細胞凋亡 在DR發病過程中，氧化應激引起的線粒體活性氧類(reactive oxygen species，ROS)是調節細胞凋亡的活性介質[12-13]。在生理條件下，以活性氮、ROS、羥基自由基和過氧化氫為主的自由基產生是正常的。事實上，中低水平的自由基是生理活動所必需，因為它們作為氧化還原信號的信使，促進細胞代謝、增殖、分化、免疫系統調節和血管重構。正常生理狀態下，細胞使用酶和非酶抗氧化防御系統維持它們的正常水平。然而，過量ROS擾亂氧化還原穩態會引起氧化應激，從而破壞蛋白質、脂質、糖類和核酸等生物大分子[1]。臨床和試驗研究已證實，糖尿病患者的MMP-2表達增加[14]，MMP-2在DR發病過程中發揮重要作用，而MMP-2的激活受到超氧化物的控制[15]。在高糖培養視網膜血管內皮細胞的實驗中，學者發現MMP-2明膠酶活性較正常葡萄糖濃度培養的細胞升高30%～40%；MMP-2的細胞膜激活子膜型基質金屬蛋白酶1(membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP)基因表達增加25%，而細胞內抑制子TIMP-2下調70%[11]。通過轉染MMP-2小干擾RNA，可以明顯改善高糖引起的線粒體超氧化物增多以及線粒體腫脹[11]。線粒體是細胞能量的主要來源，其主要作用是產生ATP、控制細胞代謝及調節細胞凋亡，故線粒體功能障礙嚴重影響細胞穩態。因此，視網膜毛細血管細胞的線粒體功能障礙可以激活細胞凋亡通路，從而在DR的發病機制中發揮重要作用[14]。

熱激蛋白(heat shock protein，HSP)60是一種線粒體蛋白，其在促進蛋白質折疊和維持線粒體完整性方面發揮重要作用，如在成年小鼠心肌細胞中HSP60的缺失導致心力衰竭，并顯著干擾線粒體蛋白穩態和線粒體功能；在血管平滑肌細胞中可以觀察到HSP60活化激活，阻止細胞凋亡并促進受損血管的新內膜增厚[16]。在應激狀態下，HSP60在胞質中累積[17]。在高糖條件下，視網膜HSP60在線粒體內的積累顯著減少，在細胞質內積累顯著增加，HSP60與MMP-2之間的相互作用增加。同時，高糖環境亦增加了視網膜線粒體促凋亡基因Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)的表達[11-12]。此外，HSP60還可與HSP家族的另一成員HSP70相互作用[18]，這與Bax的構象變化和線粒體釋放細胞色素C的調節有關[19]。Bax和細胞色素C在線粒體上的轉移受MMP-2與HSP60相互作用的控制，進一步證實了HSP60在線粒體損傷中的作用。間隙連接蛋白(connexin，Cx)43是Cx中的一員，有助于細胞間的通訊和離子的轉移，在糖尿病患者的視網膜中表達下調，且MMP-2與Cx43之間的相互作用減弱[14]。在正常大鼠玻璃體內注射MMP-2后，視網膜線粒體被破壞，線粒體中的HSP60和Cx43水平降低，同時毛細血管細胞凋亡增加[14]。因此高血糖激活線粒體中的MMP-2，繼而可能通過調節HSP60和Cx43破壞線粒體的完整性，致線粒體膜電位丟失、運輸通道受損，Bax進入線粒體，釋放細胞色素C，激活細胞凋亡機制，從而使視網膜毛細血管細胞凋亡加速，進而導致微血管通透性增加、滲漏等一系列病理過程。

此外，視網膜血管內皮細胞中葡萄糖誘導的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly-(ADP-ribose) polymerase，PARP]激活也受MMP-2的調控。MMP-2的激活可裂解細胞核PARP[20]，且由于細胞核與線粒體之間存在明顯的串擾，PARP的裂解可通過線粒體途徑，即通過線粒體釋放凋亡誘導因子引起細胞凋亡，最終促進細胞色素C的釋放[21-22]。Mohammad和Kowluru[11]的體內試驗表明，通過過表達線粒體超氧化物歧化酶，調節糖尿病患者視網膜中線粒體超氧化物的積累，也可以抑制MMP-2的活性及其調節劑表達水平升高，且此結果與體外實驗結果一致。

2.2增殖期促進新生血管產生 在DR發展的晚期，隨著毛細血管基膜的增厚和周細胞、內皮細胞的丟失，開始出現新生血管和側支血管，這是PDR的顯著特征。缺氧時，新生血管通常起源于視網膜循環的靜脈側，最初在視盤上可見細小的血管簇。這些新血管在玻璃體中三維生長。由于這些新血管易碎，容易出血，玻璃體內可見小出血。當出現明顯出血和黃斑模糊時，會突然發生嚴重的視力喪失。當新生血管成熟時，結締組織發育，纖維化(瘢痕)使玻璃體對視網膜產生牽引力，這可能導致牽引力性視網膜脫離[23]。

MMP-2有助于血管生成，并涉及多種機制。如MMP降解毛細血管基膜，這是內皮細胞穿透內皮下基質和形成新管腔的必要條件；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認為是DR發展的主要生長因子之一[24]，維持視網膜細胞的結構和功能穩態依賴于VEGF的正常表達，但在缺氧和高血糖等病理因素的作用下，其過表達可導致血管內皮通透性增加，凋亡蛋白的抑制作用減弱，血管穩態的破壞以及視網膜新生血管的形成[25]。MMP是VEGF介導的細胞增殖和新血管形成的活躍分子[26]，VEGF能夠誘導MMP表達并促進視網膜新血管形成[25]。同時，MMP還促進了結合VEGF的組織可用性[23]。研究顯示，PDR患者視網膜新生血管膜MMP-2活性升高[27]。此外，PDR患者存在激活的ProMMP-2，纖維血管組織中ProMMP-2的激活被認為是其與MT1-MMP和TIMP-2的相互作用介導[28]。

細胞外基質蛋白水解被認為是病理性血管生成所必需的最早和最持久的活動之一。MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)在細胞外基質降解中起重要作用，是新生血管從視網膜逃逸并侵入玻璃體腔的必要步驟，是PDR的標志。MMP-2在神經節細胞層、內叢狀層、內核層和突破內界膜的新生血管中均有表達。研究發現，與對照組相比，PDR組患者房水、玻璃體和血漿中的MMP-2水平顯著升高，由此推測MMP-2可能參與調節PDR患者視網膜血管生成過程[29]。

缺氧性米勒細胞分泌的VEGF增加了血管內皮細胞MMP-2的表達及活性，從而促進PDR視網膜新生血管形成。Rodrigues等[29]研究發現：缺氧誘導因子1α在視網膜血管內皮細胞中的表達增加可以直接促進MMP-2的表達；缺氧誘導因子1α在米勒細胞中表達增加可以誘導VEGF分泌，進而引起鄰近內皮細胞中MMP-2表達的增加和活性提高；缺氧誘導的內皮細胞中MMP-2的表達可通過TIMP-2的上調來平衡，而VEGF誘導的MMP-2表達不能通過TIMP-2水平的升高來平衡。低氧環境中米勒細胞分泌的VEGF和鄰近內皮細胞在視網膜新生血管的MMP-2調控中存在復雜的相互作用，并確定MMP-2是治療PDR的靶標[30]。因此，VEGF處理內皮細胞后，MMP-2活性明顯升高，從而促進內皮細胞端部MMP-2的表達。值得注意的是，TIMP-2在MT1-MMP激活MMP-2中也發揮了一定作用[31]。此外，MT1-MMP本身也是一種膠原酶，其在PDR中可能獨立于MMP-2在纖維血管增殖的發展中發揮直接作用[32]。

以上研究結果表明，缺氧誘導因子的穩定對于促進缺氧內皮細胞中MMP-2的表達是必要和充分的。而MMP-2的表達是由米勒細胞分泌因子誘導。研究顯示，采用缺氧永生化人米勒細胞的條件培養液處理永生化人臍靜脈內皮細胞后，其MMP-2信使RNA水平顯著高于正常永生化人米勒細胞條件培養液處理的永生化人臍靜脈內皮細胞，提示缺氧米勒細胞分泌的因子促進了內皮細胞中MMP-2的表達。

3 MMP-2抑制劑治療DR的潛在應用

MMP在PDR患者視網膜新生血管組織和水溶液中表達水平升高[33]。研究證明，與對照者相比，無論是否接受過全視網膜光凝治療，PDR患者MMP-2水平均升高，表明MMP-2在接受過PDR治療的患者中也是一個治療靶點[33]。在動物模型中，MMP的廣譜藥理抑制可以防止視網膜新生血管[34]。因此，以MMP-2為靶點的治療可以成為PDR患者預防或治療新生血管的一個重要而有效的部分。

隨著以MMP-2為靶點的DR治療進入科學家的視野，MMP-2抑制劑成為DR治療藥物研發的焦點。廣譜抑制劑(如GM6001)和許多選擇性小分子抑制劑因毒性、選擇性差或治療效果不佳等缺點阻礙了其發展。而針對特定MMP(如MMP-2)抑制性抗體的開發有望成為未來的治療方法。雖然這一領域尚未引起人們的廣泛關注，但個別針對單個MMP抑制性抗體的研發已經取得了顯著成果[35-37]。研究發現，高效、高選擇性抗MMP-9單克隆抗體GS-5745(Andecaliximab)在潰瘍性結腸炎和胃癌的治療中顯示出良好療效；GS-5745單獨以及與mFOLFOX6聯合應用對未經治療的胃癌和胃食管交界腺癌患者的療效和安全性目前正在進行Ⅲ期臨床試驗[38]。MMPI-1154和MMPI-1260是一種新型心肌細胞保護性小分子MMP-2抑制劑，可用于治療急性心肌梗死[39]。MMP-2抑制劑ARP100在缺血再灌注損傷的心肌細胞中具有改善心臟收縮功能的作用[40]。此外，在視網膜母細胞瘤的Weri-1細胞中，ARP100可顯著降低VEGF的表達和細胞活力[41]。隨著這一領域不斷取得新成果，開發一種針對MMP-2的藥物并用于DR治療的可能性顯著增加。

4 小 結

目前，DR的治療專注于疾病后期，通過暫時防止異常視網膜血管的形成來延緩視力喪失。但當前的治療方法無法恢復受損的神經組織或100%恢復視力。DR中的視網膜損傷和新血管形成過程與糖尿病患者的高血糖環境密切相關。而保護視網膜和避免這種疾病發展主要針對細胞凋亡、超氧化物蓄積和新生血管生成。而體外和體內試驗研究提供了MMP-2抑制劑作為潛在藥物預防上述病理學進展的證據。因此，特異性靶向MMP-2抑制性抗體有望成為未來的治療方法。