環狀RNA在肝纖維化中的作用機制研究進展

葉志榮，林暉，繆輝來

(廣東醫科大學附屬第二醫院肝膽外科，廣東 湛江 524023)

環狀RNA(circular RNA，circRNA/circ)是一類由外顯子或外顯子-內含子經共價鍵連接而成的環形非編碼RNA，最初被認為是錯誤剪輯的廢棄產物，隨著對非編碼RNA研究的深入，circRNA的生物學功能也逐漸被發掘。由于circRNA沒有5′端帽子和3′端poly(A)尾巴，其序列高度保守，且結構穩定；此外，circRNA可充當微RNA(microRNA，miRNA/miR)的分子海綿，競爭性抑制miRNA，從而調控下游基因和蛋白的表達，這些特征及生物學功能使circRNA成為繼小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)、miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-cording RNA，lncRNA) 之后的又一研究熱點[1]。目前關于circRNA的研究主要集中于生物標志物和miRNA海綿調控作用，但隨著對circRNA研究的深入，發現其在兔網織紅細胞系統等特定條件下可翻譯蛋白并發揮細胞調節功能，這一發現顛覆了人們對circRNA是非編碼RNA的認知，為circRNA的研究開辟了新方向[2]。肝纖維化是肝損傷常見的病理轉歸，但肝纖維化的修復及逆轉機制目前尚不明確。有證據表明，circRNA與肝纖維化等相關疾病的發生發展密切相關[3]。現就circRNA在肝纖維化中作用機制的研究進展予以綜述。

1 circRNA的生物學功能

1.1翻譯蛋白 Abe等[2]參考聚合酶鏈反應的滾動擴增技術，將含有無限開放閱讀框的circRNA在無細胞的大腸埃希菌翻譯系統中成功翻譯成蛋白質。為了證明細胞中circRNA的翻譯功能，研究者合成了含有標簽序列的circRNA，并分別轉染至兔網織紅細胞系統和HeLa細胞系中，通過免疫熒光染色及蛋白質印跡法檢測證實，在活細胞內即使無內部核糖體進入位點序列、polyA尾或帽結構，circRNA分子仍可順利翻譯成蛋白質并發揮功能[4]。circRNA翻譯功能的發現為circRNA研究提供了新的思路。研究發現，circRNA含F-框WD重復域蛋白7基因編碼一個新蛋白含F-框WD重復域蛋白7-185aa，可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖[5]；肝癌細胞中的circRNA β聯蛋白(β-catenin)翻譯產生一種同工型蛋白β-catenin-370aa，可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進肝癌細胞的生長[6]。

1.2作為miRNA海綿 與線性RNA相比，circRNA結構穩定性更好，可在人體血液、唾液等體液中分泌表達，并在不同位置表現出特異性。研究發現，circRNA含有許多miRNA結合位點，因此可阻斷或降低miRNA抑制基因的作用，這種抑制作用是指circRNA通過其種子序列與信使RNA的3′非翻譯區以堿基配對的形式結合，進而抑制信使RNA翻譯或促進信使RNA降解[7-8]。RNA的海綿作用是指circRNA作為競爭性內源RNA對靶基因的表達進行調節。circRNA與堿基互補配對的miRNA競爭性結合，以海綿樣吸附作用降低miRNA豐度，同時抑制其表達，從而調控miRNA下游靶基因和蛋白的表達，影響細胞的功能及相關疾病的發生發展。在肝癌細胞中，circRNA同源結構域相互作用蛋白激酶3海綿樣結合miR-124，并通過抑制miR-124豐度上調水通道蛋白3的表達，促進肝癌細胞的增殖和遷移[9]；在二氧化硅誘導的肺纖維化疾病中，circRNA小腦變性相關蛋白1反義轉錄物作為miR-7海綿競爭性抑制miR-7，并通過下游miR-7/轉化生長因子-β2信號通路促進肺纖維化的形成[10]；Wang等[11]證實，circRNA MTO1(mitochondrial tran-slation optimization 1)可通過結合miR-17-5p上調Smad7的表達。另外，mmu_circ_42398可通過結合miR-338-3p上調BMP激活素膜結合抑制因子同源物的表達，抑制Smads蛋白的磷酸化水平，進而通過調控轉化生長因子-β1/Smad信號通路抑制肝纖維化的進展[12]。

1.3調控基因轉錄 有研究發現，circRNA在基因調控過程中發揮重要作用[13]。隨著生物信息和基因測序技術的發展，circRNA在基因調控過程中的作用逐漸明確，相關基因轉錄和翻譯的大規模數據已成為科研人員研究基因調控的重要資源和依據。一些circRNA通過調控基因轉錄過程中的關鍵環節發揮生物學功能。如RNA聚合酶Ⅱ相關的circRNA真核翻譯起始因子3J和circRNA多聚腺苷酸結合蛋白相互作用蛋白2在HeLa細胞和HEK293細胞核中作為順式作用元件調節其親本基因的表達；circRNA真核翻譯起始因子3J和circRNA多聚腺苷酸結合蛋白相互作用蛋白2還可通過與U1 snRNA特異性RNA-RNA相互作用生成U1 snRNA復合物，然后cirRNA cRNA-U1 snRNA復合物在親本基因啟動子上進一步與RNA聚合酶Ⅱ轉錄復合物結合，達到刺激轉錄和增強基因表達的目的[14]。

1.4調節蛋白功能 除了調節基因轉錄和翻譯，circRNA還可作為適配器調節蛋白之間的相互作用和蛋白的活性。Du等[15]研究發現，circRNA叉頭框轉錄因子O3(forkhead box O transcription factor 3，FoxO3)在小鼠乳腺癌4T1細胞系和黑色素瘤B16細胞系中均特異性低表達，并作為適配器連接細胞周期蛋白依賴性激酶2和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，通過形成circRNA Foxo3-p21-細胞周期蛋白依賴性激酶2三元復合物抑制細胞周期蛋白依賴性激酶2的功能，從而延緩細胞周期進程。此外，circRNA FoxO3還可同時結合p53和鼠雙微體2基因，在鼠雙微體2基因調節p53的多聚泛素化功能中起雙重調節作用，過表達circRNA FoxO3可顯著抑制鼠雙微體2基因多聚泛素化功能，促進細胞凋亡[16]。

2 circRNA在肝纖維化中的作用

2.1circRNA與肝纖維化形成機制 circRNA是非編碼RNA領域的研究熱點之一，在揭示疾病發病機制、探究診斷標志物及治療靶點等方面均取得了一定進展[17]。有研究發現，circRNA與原發性肝癌、脂肪肝等慢性肝臟疾病相關[18]。有研究指出，可將circRNA作為診斷原發性肝癌的主要標志物之一[19]。另外，circRNA還與肝纖維化的發生發展相關[18]，但關于其具體機制的研究較少。肝纖維化是肝臟損傷和修復過程中產生的病理現象。肝纖維化主要由細胞外基質和α-平滑肌肌動蛋白過量沉積導致，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)在損傷的刺激下轉化為肌成纖維細胞是細胞外基質的主要來源。因此，HSC的激活是肝纖維化的必要條件，HSC也是目前公認的肝纖維化關鍵細胞[20]。激活的HSC可分泌成纖維細胞生長因子、基質金屬蛋白酶等細胞因子，調節肝纖維化進程[21]，并釋放富含circRNA等信號分子的細胞外囊泡，調節鄰近的肝細胞及肝竇內皮細胞，甚至驅動靜息狀態的HSC活化，促進肝纖維化的發生發展[22]。

此外，circRNA還可通過miRNA海綿功能調控HSC的功能及狀態，從而介導肝纖維化的發生和進程。Zhu等[23]報道，胸腺素β4通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路在HSC中發揮抗肝纖維化作用，利用基因芯片檢測胸腺素β4缺失HSC中circRNA的差異表達發現，circRNA-0067835顯著上調，而敲除circRNA-0067835則可顯著抑制HSC的增殖并促進其凋亡；進一步研究發現，circRNA-0067835具有miR-155海綿功能，其可通過競爭性抑制miR-155上調Foxo3a和蛋白激酶B的表達，證實circRNA-0067835可通過miR-155/FoxO3信號通路介導胸腺素β4的抗肝纖維化作用。Ji等[24]研究發現，在小鼠肝損傷模型和轉化生長因子-β1激活的人HSC細胞模型中hsa_circ_0070963的表達均顯著下調，并證實hsa_circ_0070963作為miR-223-3p海綿可通過miR-223-3p/LEMD3(LAP2-emerin-MAN1 domain-containing protein 3)信號通路抑制HSC的活化，進而抑制肝纖維化的發生。表明circRNA可調節肝纖維化關鍵細胞HSC的活化與功能，因此可作為抑制HSC活化的治療靶點，促進肝纖維化的逆轉。

2.2circRNA與各種肝病引起的肝纖維化 肝細胞纖維化和早期肝硬化均可通過早期干預逆轉，因此盡早治療可顯著降低肝衰竭風險、改善患者預后[25]。目前肝纖維化的早期診斷存在創傷大、特異性差等問題，因此尋找肝纖維化的特異性標志物和治療靶點對肝病治療具有重要意義。2017年，Chen等[26]首次報道了circRNA與HSC活化有關，該研究采用基因芯片技術分析了放射線誘導的人HSC LX-2細胞活化模型的circRNA差異表達譜，并證實hsa_circ_0071410可特異性結合miR-9-5p，通過miRNA海綿作用影響HSC的活化水平。Wang等[11]研究發現，患者體內血清circRNA MTO1水平與肝纖維化的進展呈顯著負相關，且體外HSC細胞活化實驗模型進一步證實，circRNA MTO1可通過結合miR-17-5p上調Smad7的表達，從而抑制肝纖維化的進展。另外，Zhu等[23]研究發現，circRNA-0067835可通過調節miR-155/Foxo3信號通路影響HSC的活化。以上研究均表明，部分circRNA可影響肝纖維化進展中的關鍵環節——HSC活化，但circRNA與肝纖維化的關系及具體機制仍需進一步研究。

2.2.1circRNA與病毒性肝炎 病毒性肝炎是目前我國最常見的肝臟疾病，也是肝纖維化最主要的原因之一。早期病毒性肝炎雖無明顯癥狀，但持續、輕微的炎癥損傷累積可導致肝硬化和肝細胞癌，目前丙型病毒性肝炎的根治率約90%，而乙型病毒性肝炎尚無根治手段，全球每年約有85萬人死于乙型病毒性肝炎繼發的肝損傷疾病[27]。Wang等[11]在慢性乙型肝炎患者血清中發現差異表達的circRNA MTO1，且circRNA MTO1的表達與纖維化分期及Knodell組織學活動指數呈負相關，結合circRNA特性，circRNA MTO1具有成為肝纖維化新診斷標志物的潛力；進一步研究發現，circRNA MTO1還參與了轉化生長因子-β1激活HSC的過程，并作為miR-17-5p海綿抑制miR-17-5p及下游Smad7的表達，進而抑制慢性乙型肝炎相關的HSC活化和肝纖維化的發生發展。國外一項研究參照Miravirsen的鎖核酸修飾反義寡核苷酸技術人工合成了一個circRNA分子，并將其作為miR-122分子海綿，結果發現，該circRNA不僅可下調miR-122的表達，還可與丙型肝炎病毒增殖所需的宿主因子hnRNP L等結合，甚至可以與丙型肝炎病毒蛋白結合，阻斷其增殖和傳播[28]。由此可見，circRNA可能成為各種病毒性肝炎肝纖維化的診斷標志物和治療靶點。

2.2.2circRNA與酒精性肝病 乙醇是化學性肝損傷的首要因素，酒精性肝病是僅次于病毒性肝炎的第二大肝硬化致病原因。目前針對酒精性肝病的治療方法較少，主要以戒酒和保肝治療為主，對于嚴重酒精性肝炎患者，應用糖皮質激素是目前降低患者病死率的唯一有效療法[29]。有學者發現，乙醇喂養小鼠肝臟庫普弗細胞中circ_1639表達上調，而過表達circ_1639可通過miR-122海綿作用調節下游人腫瘤壞死因子受體超家族成員13C的表達，從而激活核因子κB信號通路，而敲低circ_1639表達則可降低酒精性肝病的炎癥反應及纖維化程度，為酒精性肝病及其繼發的肝纖維化提供新的治療靶點[30]。

2.2.3circRNA與藥物性肝損傷 肝臟是藥物代謝的重要場所，藥物性肝損傷是臨床藥物治療最常見的不良反應之一。Shen等[31]對我國308所醫院25 927例藥物性肝損傷確診患者的回顧性分析發現，我國藥物性肝損傷的發生率較高，其中藥物危害最嚴重的是傳統中藥制劑和抗結核藥，其主要通過引起藥物損傷性肝纖維化導致患者因肝硬化和肝衰竭死亡。Li等[32]利用過氧化氫誘導的肝細胞損傷模型研究發現，circRNA-4099與miR-706在受損肝細胞中相互調節，circRNA-4099通過觸發Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1/核因子E2相關因子2和p38促分裂原活化的蛋白激酶信號通路抑制miR-706的表達，從而促進過氧化氫誘導的肝細胞凋亡，導致肝纖維化。

2.2.4circRNA與放射性肝損傷 放射性肝損傷是肝癌放療的常見并發癥，也是胸部和上腹部放療最嚴重的并發癥[33]。放射性肝損傷常伴隨circRNA的異常表達，表明circRNA可能參與肝細胞對輻射的反應和纖維化過程。circRNA可通過抑制或減弱相關基因的表達，減弱輻射誘導的HSC活化，輻射損傷主要通過刺激HSC活化引起纖維化物質及炎癥因子釋放，導致持續的瘢痕形成和炎癥損傷，從而引起肝纖維化，進而導致肝大和腹水等嚴重癥狀；另外，在輻射和脂多糖刺激誘導下，人HSC LX-2細胞中circRNA TUBD1(tubulin delta 1)的表達顯著升高，而通過小干擾RNA敲除circRNA TUBD1的表達則可抑制LX-2細胞增殖并促進其凋亡，同時顯著降低輻射和脂多糖損傷的LX-2細胞中炎癥因子的水平；circRNA TUBD1還可作為miR-146a-5p海綿，通過Toll樣受體4信號通路調控HSC的激活，從而參與輻射對肝細胞的損傷和纖維化過程[34]。Chen等[35]發現，在輻射損傷的HSC LX-2細胞中，circRNA重構剪切因子1與miR-146a-5p海綿樣結合，通過增加下游Ras相關的C3肉毒素底物1的表達增強受損LX-2細胞的活力和肌成纖維細胞表型轉化，促進炎癥因子和α-平滑肌肌動蛋白釋放，加重肝纖維化。以上研究均表明，circRNA參與調節輻射損傷的HSC活化和纖維化物質釋放，為放射性肝損傷中肝纖維化的治療提供了新方法。

2.2.5circRNA與非酒精性脂肪性肝炎 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，而非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是NAFLD的關鍵階段，若治療不及時可導致肝硬化、終末期肝病與肝細胞癌[36]。NAFLD的發病機制目前尚不明確。circRNA與NAFLD及肝再生機制相關[37]。在NASH發病機制的研究中，研究者首先通過基因芯片技術檢測小鼠NASH模型，檢測出可同時促進circRNA與抑制信使RNA表達的miRNA——miR-122，然后利用circRNA、miR-122和信使RNA隨機組建4組circRNA-miRNA-信使RNA網絡，最后通過研究4組circRNA-miRNA-信使RNA網絡對肝損傷的影響，發現NASH的發生發展與circRNA密切相關，提示circRNA有成為NASH治療靶標的潛力[38]。另有研究發現，傳統中醫強肝藥方可顯著改善NASH患者的癥狀，研究者用強肝藥方提取物喂養小鼠并建造模型，高通量測序結果表明，小鼠肝臟中的circ_0007379表達顯著上調，而circ_004572表達下調，可能與強肝藥方治療NASH的機制相關[39]。

3 小 結

肝纖維化發病機制復雜，目前臨床尚無理想的治療方法。隨著生物學技術的發展，circRNA對肝纖維化的調節作用不斷被發現。多種circRNA均參與了肝纖維化關鍵細胞HSC的增殖與活化水平的調節，并發揮了重要的生物學功能。目前針對circRNA生物學功能的研究主要集中于miRNA海綿功能，對circRNA的轉錄和調控蛋白表達等生物學功能的研究仍處于起步階段，還有待進一步研究闡明。未來，結合circRNA的特性對肝纖維化發展過程深入探索，可為肝纖維化的研究提供新方向，且隨著研究的深入，RNA干擾技術將為肝纖維化的治療提供新思路。