NLRP3炎癥小體與草酸鈣腎結石形成的研究進展

齊士勇，徐勇

(天津醫科大學第二醫院泌尿外科 天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

我國是世界上腎結石的高發地區。統計學數據顯示，我國成人腎結石的發病率高達5.8%[1]，其中80%的腎結石含有草酸鈣，且以草酸鈣為主要成分，腎臟結石的復發率可達70%以上[2-3]，嚴重影響患者身體健康，且加重醫療負擔。因此，尋找有效的草酸鈣腎結石防治措施有助于解除患者痛苦、降低醫療支出，而闡明結石的形成機制是其關鍵。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎癥小體是位于細胞質內的蛋白質復合體。外源性危險信號(如病原微生物)和內源性危險信號(如草酸鈣晶體)可激活效應細胞內的NLRP3炎癥小體，進而釋放效應分子[如白細胞介素(interleukin，IL)-18 和IL-1β等]促進疾病的發生。目前一致認為，NLRP3炎癥小體激活與炎癥疾病的發生相關。但隨著認識的深入，NLRP3炎癥小體在代謝性疾病發生、發展中的作用受到重視。草酸鈣結石是常見的腎臟代謝性疾病。有文獻報道，草酸鈣腎結石形成過程中存在NLRP3炎癥小體的激活，且其激活依賴于大量活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的產生[4-6]。然而，NLRP3炎癥小體激活及其激活后促進草酸鈣結石形成的具體機制仍不清楚?，F就NLRP3炎癥小體及其激活途徑、激活后造成腎小管上皮細胞損傷以及導致腎小管上皮黏附性改變的機制進行綜述。

1 NLRP3炎癥小體的構成及生物學作用

NLRP家族成員在機體的固有免疫中起著關鍵性作用，可激發機體免疫應答、清除有害刺激。目前，在人類細胞內已發現23種NLRP家族相關分子，在小鼠等動物細胞內已發現34種以上NLRP分子[7]。NLRP家族激發機體產生免疫應答的功能與其特殊的分子結構相關。典型的NLRP結構包括以下三個關鍵部分：①N端結構域為發生效應的區域，可促進不同蛋白分子之間發生生物學效應；②中間NOD結構域為連接區域，可導致NLRP分子本身的寡聚化，發揮相互連接功能；③C端為亮氨酸富集的結構域，可進行自身調控并識別病原體相關分子。既往研究發現，NLRP1可與胱天蛋白酶(caspase)5結合，通過凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)與caspase-1發生相互作用，進而形成蛋白質復合體，將其命名為炎癥小體[8]；炎癥小體進一步活化caspase-1前體使其轉變為有功能的caspase-1，促進炎癥因子(如IL-1β)的成熟及釋放，最終發生相應的生物學效應。自此，NLRP家族相關炎癥小體及其激活促進疾病發生發展的作用受到廣泛的重視和研究。

在NLRP家族眾多成員中，NLRP3炎癥小體與疾病關系最為密切，且研究最多。NLRP3炎癥小體的組成包括NLRP3、無活性caspase-1和ASC。NLRP3與NLRP其他家族成員均具有典型的特征性結構域，即C端是識別相應配體并進行自身調節的含亮氨酸的富集區域，中間區域為起連接作用的NBD區域(也稱為NOD或NACHT區域)，此區域屬于核苷水解酶超家族成員，可將ATP水解成鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)；N端含有一個caspase募集結構域(caspase recruitment domain，CARD)或稱熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)的效應結構域，其與具有相同結構域的其他分子結合產生一系列生物反應，進而參與機體效應細胞的炎癥反應過程，其中最關鍵的是該區域可通過CARD-CARD連接的方式使ASC發生聚集。ASC在NLRP3炎癥小體復合體中起著連接蛋白的作用，其C端含有與caspase-1前體相同的PYD募集結構域，N端則含有與NLRP3相同的CARD連接結構域。通過CARD-CARD及PYD-PYD的橋梁作用，ASC將caspase-1前體與NLRP3連接，從而起到雙重銜接蛋白的作用。當caspase-1前體富集區域達到相對較高濃度時，蛋白酶原以水解的方式將四聚體自身活化，從而形成具有蛋白酶活性的異二聚體caspase-1，此過程稱為NLRP3炎癥小體激活。炎癥小體激活后，caspase-1作為效應蛋白進一步剪切無活性的IL-1β及IL-18前體，使其轉變為成熟的IL-1β和IL-18。效應細胞釋放IL-1β和IL-18，從而引起炎癥反應[9]。

2 NLRP3炎癥小體激活途徑和負性調節

外源性或內源性刺激信號激活效應細胞內的NLRP3炎癥小體，其激活分為兩個階段：①啟動環節，即NLRP3表達上調。②激活環節，即NLRP3炎癥小體形成，促進caspase-1及IL-1β等效應分子產生[10]；進而caspase-1參與細胞的程序性死亡，IL-1β促發組織的炎癥反應。

激活NLRP3炎癥小體的危險信號包括外源性和內源性信號。外源性信號包括各種微生物(細菌、真菌及病毒等)及其代謝分子。不同種類微生物激活NLRP3炎癥小體的方式不同，就細菌而言，多數革蘭陽性球菌及革蘭陰性桿菌能夠通過細胞內氧化應激方式激活NLRP3炎癥小體，誘發機體的免疫應答，從而發揮保護機體的作用；在真菌方面，白假絲酵母菌及釀酒酵母菌可以利用脾臟酪氨酸激酶介導的細胞信號通路促進NLRP3炎癥小體活化，從而激發炎癥反應；就病毒來講，不同病毒激活炎癥小體的方式不同，腺病毒能通過其DNA發揮作用激活NLRP3炎癥小體，而一些流感病毒利用M2離子通道的開放引起細胞內相關離子(如鉀離子)濃度改變激活NLRP3炎癥小體；另外，一些病原微生物可產生毒素使細胞膜發生破壞，導致細胞內外離子濃度改變，進而激活NLRP3炎癥小體[11]。內源性危險信號主要指體內一些代謝產物[12]，包括草酸鈣結晶、膽固醇結晶、尿酸結晶、胱氨酸結晶及某些多肽物質等。NLRP3炎癥小體可被上述內源性代謝產物激活，促進效應分子IL-1β等釋放，引起一系列代謝性疾病的發生。因此，NLRP3作為一種模式識別受體在識別多種內外源性危險信號過程中起著關鍵性作用。各種危險信號促使NLRP3炎癥小體激活的確切機制仍不清楚，可能與激活離子途徑、ROS和溶酶體途徑及負性調控有關[13]。

2.1離子途徑激活 鉀離子外流是NLRP3炎癥小體激活最常見的機制。此過程中，細胞內的鉀離子順著離子濃度梯度向細胞外流動，從而誘導線粒體功能受損、破壞，進而導致ROS和線粒體DNA釋放，激活NLRP3炎癥小體。有關鉀離子外流的機制尚不完全清楚，目前有以下幾種解釋：危險信號直接破壞細胞膜，鉀離子順濃度梯度外流[14]；細胞周圍環境內的ATP與細胞膜上的P2X7受體結合并激活該受體，進而誘發其控制的膜離子通道蛋白開放，引起細胞內鉀離子外流[15]；一些微生物作用于效應細胞后介導細胞膜微孔結構形成，通過這些微孔結構鉀離子亦可發生外流[16]。

鈣波傳遞是細胞之間信息交流的一種途徑，NLRP3炎癥小體激活過程中鈣波傳遞起重要的調節作用。鈣波傳遞激活NLRP3炎癥小體的機制可能是鈣離子與鈣離子受體結合導致鈣離子受體活化，進而激活NLRP3炎癥小體。在鈣波傳遞過程中，鈣離子受體活化引起NLRP3炎癥小體激活可能存在以下兩方面的作用：①鈣離子受體活化后導致內質網內的鈣離子被釋放，引起細胞內鈣離子濃度呈持續增高，繼而損壞線粒體的功能并釋放線粒體DNA導致NLRP3炎癥小體激活[17]；②鈣離子受體活化后可引起細胞內環腺苷酸水平降低，從而削弱了環腺苷酸對NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，導致NLRP3炎癥小體激活增加。此外，細胞外的鈣離子還可通過G蛋白偶聯受體激活NLRP3炎癥小體[18]。

2.2ROS和溶酶體途徑激活 ROS在NLRP3炎癥小體激活過程中亦起著重要作用。近年來，線粒體來源ROS在此生物過程中起著主導作用。ROS抑制劑可抑制NLRP3炎癥小體激活，減輕靶細胞的損傷，進而延緩疾病的發展。細胞膜上還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活與大量ROS的產生密切相關。當機體效應細胞(如巨噬細胞)出現吞噬障礙，不能清除有害物質時，內源性晶體物質(如草酸鈣、尿酸、胱氨酸)可激活細胞膜還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，導致細胞內ROS大量生成。ROS進一步產生生物學效應，導致原本處于結合狀態的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白交互蛋白發生分離。兩者分離后，硫氧還蛋白主要通過自身氧化清除氧化物；硫氧還蛋白交互蛋白則與NLRP3相應的結構域結合，從而募集caspase-1及ASC前體，完成NLRP3炎癥小體的組裝，最終誘導NLRP3炎癥小體激活[19]。

另有研究發現，巨噬細胞在內吞病原體或晶體類物質后，可導致細胞內溶酶體發生破裂。溶酶體破裂后，其內的一些蛋白酶(如組織蛋白酶B)釋放至細胞質內[20]，后者導致效應細胞細胞膜離子通道開放，引起細胞內離子濃度發生改變，繼而促進NLRP3炎癥小體激活。Bruchard等[21]研究發現，使用小分子物質直接破壞溶酶體亦能導致NLRP3炎癥小體激活，揭示了效應細胞溶酶體破壞對于NLRP3炎癥小體激活的意義。

2.3NLRP3炎癥小體激活的負性調節 NLRP3 炎癥小體激活導致效應蛋白IL-1β和IL-18等的成熟和釋放，在感染疾病的控制中起著重要作用。目前，NLRP3炎癥小體過度激活導致的機體損傷被認為是代謝性疾病發生的根本原因。NLRP3炎癥小體過度激活與其抑制性調節機制受損存在一定關系。了解炎癥小體激活的負性調控機制有助于維持機體內環境穩態，并為代謝性疾病的治療提供新思路、新靶點。

現已發現的NLRP3炎癥小體激活負性調節機制包括[22]：①負調控蛋白機制，該類蛋白主要包括具有PYD結構域的蛋白(如熱激蛋白)及具有CARD結構域的蛋白(如caspase-12)，其主要作用是競爭性抑制NLRP3炎癥小體的激活；②細胞自噬機制，細胞自噬具有雙重作用，當自噬功能受損時NLRP3炎癥小體激活增強、活性caspase-1表達增加，表明細胞自噬具有負向調節NLRP3炎癥小體激活的作用；③其他機制，T細胞、干擾素、一氧化氮及miR-223等均可抑制NLRP3炎癥小體的激活，但其機制尚未完全明確。

3 NLRP3炎癥小體激活與草酸鈣腎結石形成

最初，NLRP3炎癥小體激活被認為與自身炎癥性疾病(如周期性發熱)的發生相關。隨著研究的深入，發現在多種代謝性疾病(如2型糖尿病、糖尿病心肌病、痛風、肥胖及非酒精性脂肪性肝炎)的發生發展過程中均存在NLRP3炎癥小體激活[23-24]。草酸鈣腎結石是一種代謝性腎臟疾病，是草酸刺激腎小管上皮細胞發生氧化應激反應而產生過量ROS，導致上皮細胞損傷和腎小管上皮細胞黏附因子表達增加，最終引起草酸鈣結晶的細胞黏附，并形成肉眼可見的結石。因此，外源性危險信號草酸刺激腎小管上皮造成腎小管上皮細胞的損傷和細胞晶體黏附性增加是草酸鈣結石形成的關鍵因素。研究顯示，使用一定濃度草酸喂養NLRP3基因缺失小鼠形成的腎臟草酸鈣結石密度較正常小鼠明顯降低[25]。另有研究顯示，NLRP3基因缺失小鼠腎小管上皮細胞內caspase-1及IL-1β表達水平較正常小鼠亦顯著下降[6]。可見，NLRP3炎癥小體激活在草酸鈣腎結石形成中起著關鍵性作用。既往研究多關注NLRP3炎癥小體是否參與了草酸鈣結石的形成，缺乏對NLRP3炎癥小體激活促進草酸鈣腎結石形成確切機制的研究。近年來，NLRP3炎癥小體激活促進草酸鈣結石形成機制研究的焦點和難點主要包括NLRP3炎癥小體激活造成腎小管上皮細胞損傷類型和本質以及腎小管上皮細胞晶體黏附性改變[26]。

3.1NLRP3炎癥小體激活與腎小管上皮細胞損傷 草酸鈣腎結石由無機鹽和有機成分組成，無機鹽主要是草酸鈣，可與水分子形成不同形式的螯合物；有機成分包括各種蛋白物質，主要來源于腎小管上皮細胞的損傷。抑制NLRP3炎癥小體激活可減輕效應細胞損傷、保護細胞功能，有助于延緩部分代謝性疾病的發展、優化疾病的預后。因此，明確NLRP3炎癥小體激活造成細胞損傷的類型和機制有助于減少腎小管上皮細胞損傷并尋找疾病新的治療靶點。

研究發現，ROS通過激活NLRP3炎癥小體造成腎小管上皮細胞損傷，進而促進草酸鈣結石形成[27]。在此過程中，ROS-NLRP3相關腎小管上皮細胞損傷可分為間接損傷和直接損傷。間接損傷是指腎間質樹突狀細胞中NLRP3炎癥小體激活，誘發腎臟間質炎癥反應，效應細胞釋放炎癥因子造成腎小管上皮細胞損傷；直接損傷是指受草酸刺激后腎小管上皮細胞內NLRP3炎癥小體激活釋放效應分子caspase-1造成腎小管上皮細胞焦亡。對腎小管上皮細胞間接損傷的研究發現，高草酸前體物質飲食大鼠及小鼠的腎組織內草酸鈣結晶廣泛沉積，晶體與腎間質樹突狀細胞作用誘發間質炎癥反應，繼發形成腎臟瘢痕，導致腎小管上皮細胞損傷，最終引起腎臟功能喪失[4]。因此，在上述病理過程中，樹突狀細胞內NLRP3炎癥小體激活起著關鍵性作用，即草酸鈣晶體導致樹突狀細胞內發生氧化應激，ROS生成增加，進而激活NLRP3炎癥小體，并產生效應分子IL-1β和IL-18，最終募集白細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，造成腎小管上皮細胞損傷，此類損傷可被IL-1R拮抗劑阻斷[28]。然而，草酸誘發的腎損傷并非依賴單一效應細胞分泌IL-1β，亦可通過其他途徑實現腎小管上皮的損傷。NLRP3炎癥小體激活后，亦可利用轉化生長因子受體相關信號通路及巨噬細胞極化誘發腎間質的炎癥反應，造成腎小管上皮細胞損傷[29]。

目前，對ROS-NLRP3炎癥小體激活所導致的腎小管上皮細胞損傷的研究多集中在草酸鈣晶體-樹突狀細胞相互作用誘發腎臟間質炎癥反應所致的間接損傷方面。然而，對于腎小管上皮細胞內NLRP3炎癥小體激活所造成的直接損傷(細胞焦亡)的研究較少。細胞焦亡是一種特殊形式的細胞損傷，是由caspase家族介導的細胞程序性死亡[30]。細胞焦亡的特點是危險性信號導致細胞膜膜孔形成，細胞發生腫脹并最終出現滲透性裂解[31-32]。研究證明，細胞焦亡參與多種代謝性腎臟疾病(如糖尿病腎病、高血壓腎病及高尿酸腎病)的發生、發展[33]。作為一種代謝性腎臟疾病，草酸鈣腎結石形成與細胞焦亡的相關性受到關注。研究顯示，草酸可通過ROS激活NLRP3炎癥小體造成腎小管上皮細胞損傷、促進結石形成[34]，并在此過程中存在腎小管上皮細胞焦亡[35]。然而，在草酸鈣結石形成過程中，NLRP3炎癥小體激活導致腎小管上皮細胞焦亡的機制尚不完全明確，尤其是腎小管上皮細胞焦亡發生時細胞膜孔形成的機制以及有關細胞膜孔大小、多少、深度及密度的研究仍缺乏，尚需進一步研究。

3.2NLRP3炎癥小體激活與腎小管細胞晶體黏附性改變 草酸鈣腎結石的形成是一個復雜的病理生理過程，包括晶體的細胞黏附、細胞表面聚集及腎小管腔內成核等，受諸多因素的調控。腎小管上皮細胞對草酸鈣晶體的黏附是結石形成的始動因素，主要依賴于上皮細胞晶體黏附因子表達增加。常見的細胞晶體黏附因子包括透明質酸、骨橋蛋白及CD44，晶體黏附因子的表達受細胞內多種信號通路的調控[36-37]。

目前有關NLRP3炎癥小體激活與腎小管上皮黏附性改變的研究尚少。研究發現，NLRP3基因缺失小鼠在高草酸飲食后，腎小管上皮細胞的細胞膜晶體黏附因子透明質酸酶和骨橋蛋白的表達水平下降，且草酸鈣結石形成程度較正常組小鼠明顯減少[6]。可見，炎癥小體通過改變細胞對草酸鈣晶體黏附性激活促進結石形成，但目前尚缺乏其相關機制的研究。初步的探索發現，ROS可通過調節p38促分裂原活化的蛋白激酶通路相關蛋白的表達上調透明質酸、骨橋蛋白及CD44等黏附因子的表達，進而增強腎小管上皮細胞對草酸鈣結晶的黏附性，促進草酸鈣結石的形成[38]。進一步研究發現，NLRP3炎癥小體激活在ROS-p38促分裂原活化的蛋白激酶通路改變細胞晶體黏附性、促進結石形成過程中起到承上啟下的作用，其通路相關節點關鍵蛋白(磷酸化p38及c-Jun等)起著重要作用[35]。目前對NLRP3炎癥小體激活促進腎小管上皮細胞晶體黏附性增加的研究取得了一定進展，但其機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。

4 小 結

NLRP3炎癥小體是NLPP家族的重要一員，NLRP3炎癥小體激活不僅與炎癥性疾病相關，還與諸多代謝性疾病相關。作為代謝性腎臟疾病的一種，草酸鈣腎結石的發生與腎小管上皮細胞內NLRP3炎癥小體激活密切相關。NLRP3炎癥小體的激活依賴于內源和外源性危險信號的刺激，其激活途徑具有多樣性和復雜性，同時受多種負性調控機制的調控。NLRP3炎癥小體激活后可通過“腎小管上皮細胞損傷”和“腎小管上皮細胞晶體黏附性改變”兩方面作用促進草酸鈣腎結石的形成。目前雖然對NLRP3炎癥小體激活在草酸鈣腎結石形成中作用的研究取得了一定的成果，但對于NLRP3炎癥小體激活機制、腎小管上皮細胞損傷機制及上皮黏附因子表達改變的機制仍需進一步深入研究，以期為尋找草酸鈣腎結石的防治靶點提供科學依據。