PB實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化山刺玫果總黃酮的提取工藝

侯少平，侯敏娜，周 蕊

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 西安 712046)

山刺玫(RosadavuricaPall.)，又名野玫瑰，是薔薇科薔薇屬的一種落葉小灌木，生長(zhǎng)于樹林邊緣，該植物耐旱，可在瘠薄區(qū)域生長(zhǎng)，主要分布在東北地區(qū)(小興安嶺以南)[1-2]。山刺玫果具有健運(yùn)脾氣、調(diào)理月經(jīng)、消食、斂肺止咳的功效，對(duì)胃積食、動(dòng)脈粥樣硬化、腹痛、月經(jīng)不調(diào)、肺咳都有療效[3]。山刺玫果具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可直接加工成果醬類食品，也是保健品以及功能性飲品的原料[4]。

目前，關(guān)于薔薇屬植物刺玫果的研究較多，而針對(duì)山刺玫果的研究較少。山刺玫果與刺玫果屬同類不同品種的植物果實(shí)，其作為鄂倫春族民族用藥，同樣具有較顯著的藥理作用。鑒于此，作者采取Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化山刺玫果總黃酮的超聲輔助提取工藝，為山刺玫果的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

山刺玫干燥成熟果實(shí)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

蘆丁標(biāo)椎品(批號(hào)：20140331)，上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯，均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

TU-1810型紫外分光光度計(jì)，北京普析儀器有限責(zé)任公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，鄭州賽特利斯；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義瑞力儀器設(shè)備有限公司；5～50 μL移液器，中國(guó)大龍；100～1 000 μL移液器，美國(guó)Thermo Fisher；DZF-6021型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SQP型萬(wàn)分之一天平，北京賽多利斯；800Y型粉碎機(jī)，皇代；YP202N型電子天平，上海精科。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，105 ℃下干燥至恒重，加甲醇溶解并定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[5-6]。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定510 nm處吸光度，以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程為：A=9.9364c+0.0039，R2=0.9996，表明蘆丁濃度在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好[5]。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 提取液中總黃酮得率的測(cè)定

取山刺玫干果粉50 g，在相應(yīng)條件下提取。提取液經(jīng)過(guò)濾后蒸干，取定量干膏用少量一定濃度乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，稀釋至刻度；精密量取1 mL提取液稀釋液，采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定510 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算山刺玫果總黃酮得率(mg·g-1)[7]。

1.5 山刺玫果總黃酮提取工藝的優(yōu)化

1.5.1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)[8-9]

影響山刺玫果總黃酮的提取因素包括提取功率、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度、pH值等。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步確定各影響因素的取值范圍，再通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)找到實(shí)驗(yàn)頂點(diǎn)(最大響應(yīng)值)即為因素的+1點(diǎn)，根據(jù)1.25倍原則得出-1點(diǎn)，即確定各因素的最佳取值范圍。

1.5.2 PB實(shí)驗(yàn)

使用Minitab 16軟件設(shè)計(jì)3個(gè)中心點(diǎn)和12組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取P值<0.05的因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定山刺玫果總黃酮的最佳提取工藝。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6軟件、Minitab 16軟件和Excel 2010繪制圖表進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定影響總黃酮得率的7個(gè)影響因素的取值范圍：提取次數(shù)為1～6次、提取液pH值為2.0～5.0、料液比為1∶(6～16)、提取功率為100～200 W、提取溫度為10～80 ℃、乙醇濃度為20%～100%、提取時(shí)間為10～60 min，共設(shè)計(jì)6組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

從表1可以看出，第4組山刺玫果總黃酮得率最高。因此，選擇第4組作為實(shí)驗(yàn)頂點(diǎn)(+1)，根據(jù)1.25倍原則得出各因素的另一水平點(diǎn)(-1)，PB實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2，PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，PB實(shí)驗(yàn)的方差分析見表4。

表2 PB實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 PB實(shí)驗(yàn)的方差分析

對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，在雙因素交互作用不明顯的前提下評(píng)估其主效應(yīng)下的7個(gè)因素，得到其回歸方程為：Y=8.6275-0.1242X1-0.2308X2+ 0.0242X3+ 0.8208X4+ 0.3608X5-0.1908X6+ 0.0858X7。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表5，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析見表7。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用5個(gè)中心點(diǎn)，29組實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行，重點(diǎn)考察各因素及因素之間的交互作用對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響，該模型的回歸方程為：Y=10.26+0.92A+0.36B-0.19C+0.22D+0.060AB+0.20AC+0.065AD-0.60BC+0.25BD-0.26CD-1.16A2-0.81B2-0.71C2-0.81D2。

2.2.2 各因素交互作用對(duì)山刺玫果總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖(圖2)

圖2 各因素交互作用對(duì)山刺玫果總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

從圖2a可知，從等高線的形狀來(lái)看，其橢圓程度不大，說(shuō)明提取功率與提取溫度的交互作用較弱；從曲面彎曲程度來(lái)看，提取功率的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，提取溫度的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說(shuō)明提取功率較提取溫度對(duì)響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素?cái)?shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，截取山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136～152 W、提取溫度取值范圍在45～55 ℃。

從圖2b可知，從等高線的形狀來(lái)看，其橢圓程度不大，說(shuō)明提取功率與提取液pH值的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來(lái)看，靠近提取功率的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集，則表明提取功率比提取液pH值對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來(lái)看，提取功率的響應(yīng)值曲面圖彎曲程度大，提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說(shuō)明提取功率較提取液pH值對(duì)響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素?cái)?shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，截取距山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)較近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136～152 W、提取液pH值取值范圍在3.40～3.60。

從圖2c可知，從等高線的形狀來(lái)看，其橢圓程度不大，說(shuō)明提取功率與乙醇濃度的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來(lái)看，靠近提取功率的等高線較靠近乙醇濃度的等高線密集，表明提取功率比乙醇濃度對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來(lái)看，提取功率的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，乙醇濃度的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說(shuō)明提取功率較乙醇濃度對(duì)響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素?cái)?shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，截取距離山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)最近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136～152 W、乙醇濃度取值范圍在55%～65%。

從圖2d可知，從等高線的形狀來(lái)看，呈橢圓形，說(shuō)明提取溫度與提取液pH值的交互作用較強(qiáng)；從等高線的疏密程度來(lái)看，靠近提取溫度的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集，表明提取溫度比提取液pH值對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來(lái)看，提取溫度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說(shuō)明提取溫度較提取液pH值對(duì)響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素?cái)?shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，截取山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取液pH值取值范圍在3.40～3.80、提取溫度取值范圍在50～60 ℃。

從圖2e可知，從等高線的形狀來(lái)看，其橢圓程度不大，說(shuō)明提取液pH值與乙醇濃度的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來(lái)看，靠近乙醇濃度的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集，則表明乙醇濃度比提取液pH值對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來(lái)看，乙醇濃度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說(shuō)明乙醇濃度較提取液pH值對(duì)響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素?cái)?shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，截取距離山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)最近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳乙醇濃度取值范圍在55%～65%、提取液pH值取值范圍在3.40～3.60。

從圖2f可知，從等高線的形狀來(lái)看，其橢圓程度不大，說(shuō)明提取溫度與乙醇濃度的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來(lái)看，靠近提取溫度的等高線較靠近乙醇濃度的等高線密集，則表明提取溫度比乙醇濃度對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來(lái)看，提取溫度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，乙醇濃度的響應(yīng)值曲面表現(xiàn)則較為平緩，說(shuō)明提取溫度較乙醇濃度對(duì)響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素?cái)?shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，截取山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)最近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳乙醇濃度取值范圍為55%～65%，提取溫度取值范圍在45～55 ℃。

2.2.3 最佳工藝的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

基于以上分析，確定山刺玫果總黃酮的最佳提取工藝為：提取功率148.09 W、提取溫度52.06 ℃、提取液pH值3.47、乙醇濃度62.38%，在此條件下，預(yù)測(cè)總黃酮得率為10.599 6 mg·g-1。根據(jù)實(shí)際可操作性原則，將最佳提取工藝優(yōu)化為：提取功率150 W、提取溫度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇濃度60%。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，得到山刺玫果總黃酮得率分別為10.72 mg·g-1、10.98 mg·g-1、10.20 mg·g-1，平均值為10.63 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相差0.03 mg·g-1，說(shuō)明工藝數(shù)據(jù)可靠，該模型具有比較好的實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)性。

3 結(jié)論

通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)山刺玫果總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：提取功率150 W、提取溫度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇濃度60%。在此條件下，山刺玫果總黃酮得率為10.63 mg·g-1。本研究先確定影響山刺玫果總黃酮的各個(gè)因素的最佳取值范圍，然后進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及PB實(shí)驗(yàn)，選取顯著因素再進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，避免因響應(yīng)面法中影響因素選取不當(dāng)而造成交互作用不明顯等現(xiàn)象。