新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的研究進(jìn)展

曾紹妤

（北海市衛(wèi)生學(xué)校附屬醫(yī)院，廣西 北海，536000）

2019年12月湖北省武漢市報(bào)告一批不明原因肺炎聚集病例，隨后經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心調(diào)查[1]，依據(jù)病毒基因組序列和病毒分離結(jié)果，確認(rèn)該病原體為一種新型冠狀病毒。并歸屬為β冠狀病毒，與2003年出現(xiàn)急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒、2012年中東呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒存在明顯差異性，被命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2，相關(guān)疾病稱之為2019 冠狀病毒（COVID-19）[2]。對(duì)上述傳播能力較大病原體，及時(shí)、準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)室診斷為確定個(gè)體感染狀態(tài)、妥善進(jìn)行患者治療及管理、調(diào)查病毒傳播途徑、控制進(jìn)一步傳播等諸多方面重要環(huán)節(jié)[3]。核酸檢測(cè)方法具有高靈敏度、低假陽性率優(yōu)勢(shì)，相比較其他檢測(cè)方式應(yīng)用效果更佳。本文就新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的研究進(jìn)展如下闡述，具體如下。

1.測(cè)序技術(shù)

第二代基因測(cè)序技術(shù)可短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量的未知基因組測(cè)序。2019-nCoV 經(jīng)患者呼吸道分泌物提取病毒ENA，構(gòu)建cDNA 文庫開展高通量測(cè)序，后續(xù)開展基因組比對(duì)分析確定新型冠狀病毒。對(duì)其優(yōu)勢(shì)分析得出，可確定未知樣本序列，疫情爆發(fā)初期階段應(yīng)用價(jià)值高。對(duì)高度疑似及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷陰性病例，測(cè)序技術(shù)可提升準(zhǔn)確性，判斷是否合并其他病原體。同時(shí)可用于判斷病毒是否變異，以便改進(jìn)檢測(cè)手段[4]。但實(shí)際操作中，測(cè)序技術(shù)對(duì)儀器、人員要求高，檢測(cè)時(shí)間長且費(fèi)用高，不適用于人群大規(guī)模篩查。納米孔靶向測(cè)序技術(shù)作為單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，經(jīng)DNA、RNA 生物納米孔時(shí)產(chǎn)生電流變化開展堿性測(cè)序，配合小型實(shí)時(shí)測(cè)序設(shè)備，可用于即時(shí)檢測(cè)[5]。納米孔靶向測(cè)序技術(shù)靈敏度高于熒光定量PCR100 倍，檢測(cè)范圍廣、成本低，反應(yīng)速度快，可作為其他檢測(cè)方法無效快速診斷選擇。

2.PCR 技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 歸屬為第二代PCR 技術(shù)，定量檢測(cè)核酸。利用核酸擴(kuò)增產(chǎn)生擴(kuò)增曲線定量計(jì)算初始濃度，常見為熒光染料法、TaqMan 探針法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 作為WHO、中國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)等單位推薦新冠肺炎確診標(biāo)準(zhǔn)之一。但大規(guī)模檢測(cè)結(jié)果得出，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 存在一定“假陰性”問題，陽性檢出率僅為30%[6]。對(duì)其原因分析得出，與待測(cè)樣本病毒載量低于常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢出限，如何提高靈敏度成為需解決關(guān)鍵。微滴式數(shù)字PCR 相比較第二代，在絕對(duì)定量檢測(cè)方面準(zhǔn)確性、靈敏度顯著偏高，在腫瘤突變基因檢測(cè)、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。相比較傳統(tǒng)PCR 技術(shù)，微滴式數(shù)字PCR 每一條模板“單分子擴(kuò)增”產(chǎn)生信號(hào)進(jìn)行分析實(shí)現(xiàn)定量，可提高靈敏度[7]。且樣本分散產(chǎn)生液滴越多，則體積越小，檢出靈敏度越高。同時(shí)，與傳統(tǒng)PCR 比較，微滴式數(shù)字PCR 對(duì)殘留樣本中蛋白、多糖抵抗作用更強(qiáng)，抑制作用削弱，相對(duì)檢出率更高。

3.核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無需熱循環(huán)儀，擴(kuò)增反應(yīng)效率高、速度快，適用于病原體核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，許多核酸等溫?cái)U(kuò)增方法被用于2019-nCoV 檢測(cè)[8]。依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）可直接對(duì)RNA 靶標(biāo)擴(kuò)增等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用含有T7啟動(dòng)子的逆轉(zhuǎn)錄引物將RNA靶標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄為含有T7啟動(dòng)子的cDNA，經(jīng)T7 RNA 聚合酶對(duì)cDNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到大量RNA 擴(kuò)增產(chǎn)物，合成RNA 擴(kuò)增產(chǎn)物重新進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增循環(huán)。在41℃進(jìn)行，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)前需在65℃進(jìn)行引物退火。NASBA 可在1.5～2h 內(nèi)將靶標(biāo)擴(kuò)增6～9 個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度達(dá)到單拷貝/反應(yīng)[9]。NASBA 技術(shù)作為DNA 靶標(biāo)擴(kuò)增，但DNA 靶標(biāo)預(yù)變性過程會(huì)促使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，仍需重新補(bǔ)加才可進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。且時(shí)間較長，流程復(fù)雜，多在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行RNA 檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）為2000年所提出一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)在60～65℃下，靈敏度達(dá)到10 拷貝/反應(yīng)。有學(xué)者開發(fā)SARS-CoV-2 可視化檢測(cè)方法，以鈣黃綠素作為LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑，1h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)20 拷貝/反應(yīng)和200 拷貝/反應(yīng)的SARS-CoV-2 基因組ORF 1ab 和S 基因靶標(biāo)的檢測(cè)。可實(shí)現(xiàn)多重病原體組和篩查，同時(shí)可利用肉眼觀察顏色變化判讀結(jié)果，降低對(duì)儀器設(shè)備要求，適用于資源有限及經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)開展核酸檢測(cè)[10]。但經(jīng)肉眼主觀判斷顏色變化存在較大個(gè)體主觀判斷差異，極易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，使得上述檢測(cè)方法準(zhǔn)確性受到影響。

4.小結(jié)

檢測(cè)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室至臨床需經(jīng)歷四個(gè)階段，概念認(rèn)證階段、少量樣本分析階段、大量患者參與臨床實(shí)驗(yàn)階段及技術(shù)商業(yè)化階段。自疫情爆發(fā)以來，臨床有關(guān)各式2019-nCoV 檢測(cè)方法層出不窮，但目前多數(shù)停留在第二步少量樣本分析階段，尚未真正商業(yè)化運(yùn)用。目前有關(guān)RT-PCR 方式被質(zhì)疑準(zhǔn)確性不佳，但血清免疫學(xué)檢測(cè)無法用于低病毒載量、無癥狀感染者篩查，PCR技術(shù)發(fā)展，可提高靈敏度，但目前尚未作為商業(yè)應(yīng)用。有關(guān)RT-PCR 核酸檢測(cè)試劑盒能及時(shí)滿足臨床需要情況下，仍需考慮如何提高2019-nCoV 檢測(cè)技術(shù)靈敏度，準(zhǔn)確性及通量，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)流水線式操作，滿足臨床篩查需求。