外泌體在年齡相關性黃斑變性發病機制與診療方面的研究進展

劉金霞，秦宇

(中國醫科大學眼科醫院 遼寧省晶狀體學重點實驗室 中國醫科大學附屬第四醫院眼科，沈陽 110005)

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degene-ration，AMD)是造成老年人不可逆性視力障礙的主要原因[1]。其可分為萎縮型(干性)和滲出型(濕性)兩種。其中，萎縮型約占80%，以黃斑區地圖狀萎縮和玻璃膜疣為特點，患者常出現視物模糊和變形癥狀；滲出型以脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization CNV)為特征，其視功能嚴重損傷的病理學基礎即黃斑區CNV形成[2]。目前，AMD的發病機制尚未完全清楚，炎癥與免疫功能紊亂、血管生成與抑制失調、光損傷及氧化應激反應等均有報道[3]。對于AMD的治療，干性AMD主要著眼于補體抑制、神經保護、細胞療法和抗炎藥物治療，濕性AMD則更注重新的、潛在更持久的抗血管內皮生長因子制劑及緩釋裝置和基因治療等[4-5]。

外泌體最初于1987年在綿羊紅細胞中發現，直徑為30～100 nm，多種體液中均含有外泌體，如血漿、血清、尿液、唾液、精液、母乳、房水和腦脊液等。由于外泌體的來源細胞多樣，其功能也各不相同[6-7]。近年來，外泌體在眼科領域的研究逐漸增加。研究顯示,視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)、睫狀體上皮細胞、小梁細胞等均可分泌外泌體[8-9]。其參與了AMD發生發展過程中的新生血管生成、玻璃膜疣形成、免疫調節等環節[2]。現就外泌體在AMD發病、診斷和治療等方面的研究進展予以綜述，以為AMD的發病機制和診療策略研究提供新思路。

1 外泌體

1.1外泌體的產生 外泌體的形成過程包括漿膜的雙重內陷以及含有腔內囊泡的多囊泡體形成。漿膜的第一次內陷形成一個杯狀結構(包括細胞表面蛋白和與細胞外環境相關的可溶性蛋白)導致早期核內體形成。隨后，早期核內體逐漸成熟變為晚期核內體，晚期核內體膜內陷產生多囊泡體(即漿膜的雙重內陷)。多囊泡體既可以與溶酶體或自噬體融合降解，也可以與質膜融合，將所含的腔內囊泡釋放成為外泌體[10]。

1.2外泌體的分離提取 目前，有關外泌體的提取方法主要有多步差速離心法、聚乙二醇沉淀法、蔗糖密度梯度離心法、免疫親和色譜法、尺寸排除色譜法等。每一種提取方法在產量、純度、成本及生物活性等方面不盡相同[11]。常用的外泌體鑒定方法包括電鏡檢測、納米粒子追蹤分析、外泌體表面蛋白檢測。其中，電鏡檢測和納米粒子追蹤分析可確定外泌體的形態、數量及直徑大小，蛋白質免疫印跡法及流式細胞術可檢測外泌體表面標志性蛋白CD9、CD63、CD81、血清膜聯蛋白A5、腫瘤易感基因101、浮艦蛋白-1等，因為這些標志物不僅可用于識別外泌體，而且與直接從細胞表面釋放的其他微囊泡相比，還顯示了外泌體在細胞內的獨特起源[12]。

1.3外泌體的生物學功能

1.3.1細胞間信號轉導 外泌體最主要的功能為介導細胞間信號轉導。細胞外囊泡分為外泌體和細胞外顆粒兩種，從母細胞中釋放后，這兩類囊泡在細胞外液中游走不同的時間和距離，隨后與靶細胞的內吞膜或質膜融合，并將腔內成分釋放到胞質中，導致靶細胞生理性能發生變化。融合后，外泌體或外泌體成分可以在新的囊泡中重新組裝，再循環至其他細胞中，激活一系列效應網絡，發揮細胞間信號轉導作用[13]。研究發現，在乳腺癌的發生發展過程中，由耐藥細胞分泌的外泌體可大量攜帶環狀RNA-UBE2D2，并將其轉移至親本細胞中；由外泌體介導轉移的環狀RNA-UBE2D2能夠與其靶基因微RNA(microRNA，miRNA/miR)-200a-3p相互作用，增強乳腺癌細胞的他莫昔芬耐藥性，為提高他莫昔芬對乳腺癌患者的療效提供新見解[14]。

1.3.2腫瘤微環境形成 自Stephen Paget于1889年提出“seed-and-soil”假說以來，器官定向性轉移一直是腫瘤最大的謎團之一[15]。Hoshino等[16]證明，來自小鼠和人類的肺、肝和腦嗜腫瘤細胞的外泌體優先與預期目的地的駐留細胞融合，即肺成纖維細胞和上皮細胞、肝庫普弗細胞和腦內皮細胞，從而形成腫瘤的轉移前微環境，促進腫瘤的器官定向性轉移。Liu等[17]研究表明，胃癌細胞系(MKN-45、MKN-28等)來源的外泌體由肺巨噬細胞和自然殺傷細胞攝取后，改變肺CD8+T細胞的基因表達和細胞因子分泌，形成一種免疫抑制的腫瘤微環境，從而促進胃腫瘤的肺轉移。

1.3.3免疫學作用 大部分免疫細胞能分泌外泌體，如樹突狀細胞、T細胞、B細胞等。而免疫細胞源性外泌體在抗原呈遞、免疫應答、免疫調節以及免疫赦免等方面均發揮至關重要的作用，可以刺激或減弱免疫反應，這些作用的發揮均取決于細胞環境、分子組成和產生免疫細胞外泌體的微環境[18]。有研究顯示，內質網應激能夠促進乳腺癌細胞分泌miR-27a-3p高表達的外泌體，這種外泌體能夠通過支架蛋白MAGI-2(membrane-associated guanylate kinase inverted-2)/人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶通路上調程序性死亡配體1的表達，從而促進乳腺癌的免疫逃逸[19]。另有研究證實了外泌體在癌癥免疫治療中的強大功能，其可作為腫瘤免疫治療的介質、藥物載體和預后生物標志物[20]。

2 外泌體與AMD

近年來，有關外泌體在眼科疾病中應用的研究逐漸增多，包括角膜疾病、青光眼、糖尿病性視網膜病變以及AMD等[11]。2012年，廖志雄等[21]首先在兔房水中分離和提取出外泌體，并發現其明顯抑制T細胞的增殖，故認為外泌體很有可能參與了眼球免疫耐受的維持。Zhang等[22]研究發現，氧化應激損傷的RPE可分泌富含白細胞介素-1β、白細胞介素-18和胱天蛋白酶1的外泌體，這些外泌體又能進一步加劇RPE的氧化應激反應。而RPE損傷與AMD的形成密切相關，因此RPE來源的外泌體可能參與了AMD的發生發展[22]。

2.1外泌體與新生血管形成 CNV是AMD患者致盲的主要原因，其以新生血管生成和視網膜下血液聚集為特征，從而對RPE造成機械性壓迫[23]。研究發現，與正常RPE比較，氧化應激損傷的RPE分泌到細胞外基質的外泌體水平升高且攜帶血管內皮生長因子受體1和2，從而影響鄰近血管內皮細胞，促進內皮細胞新生血管形成；當細胞內氧化刺激水平升高時，血管內皮生長因子受體1和2的信使RNA水平明顯升高，促血管生成效應也明顯增強[24-25]。

Hajrasouliha等[26]發現，視網膜星形膠質細胞(retinal astrocytes，RAC)分泌的外泌體具有抗血管生成作用。Zhu等[27]研究表明，從正常和高度自噬的RAC中提取的外泌體對人臍靜脈內皮細胞轉移和血管生成的作用截然不同。他們發現，從正常RAC中提取的外泌體能明顯抑制人臍靜脈內皮細胞的血管生成；而在氧化應激條件下，由于RAC自噬水平升高，從中提取的外泌體會促進人臍靜脈內皮細胞的轉移和血管生成。因此，研究RAC源性外泌體的成分及其功能，可能能為改善AMD中CNV的抗血管生成治療提供新靶點和思路。

2.2外泌體與玻璃膜疣形成 布魯赫膜是一種五氨基膜復合體，鄰近RPE的基底側，包括其基底外側細胞膜。它將RPE單層與體循環有孔毛細血管床(即脈絡膜毛細血管)分離，因此在介導流向RPE和光感受器的氧、電解質、營養物質和細胞因子，以及代謝廢物和信號分子的外排方面起至關重要的作用。早期AMD的發病機制以布魯赫膜的增厚為特征，這是由于脂質和蛋白的積累導致視網膜下沉積物的形成，稱為玻璃膜疣[28]。Klingeborn等[29]分析了在穩態條件下從RPE基底側和頂端釋放的外泌體蛋白質組，結果顯示，RPE分泌的外泌體中含有631種蛋白質，其中有299種為頂端特異性釋放，94種為基底側特異性釋放，由此推斷RPE的極性能夠影響外泌體的定向釋放。這也將為外泌體在視網膜疾病的發生、靶向治療和診斷標志物方面的應用奠定基礎。

Wang等[30-31]研究發現，線粒體DNA受損的RPE的胞吐活性增強，使攜帶細胞內蛋白的外泌體釋放增加。同時，外泌體標志物CD63、CD81和溶酶體關聯膜蛋白2在AMD患者的玻璃膜疣中出現，且CD63與玻璃膜疣表面的β淀粉樣蛋白、αB-晶體蛋白、C5b-9和補體因子H(complement factor H，CFH)共表達。因此推測在AMD患者的RPE中，由于細胞的胞吐活性增強，細胞內蛋白通過外泌體釋放增加，從而促進玻璃膜疣的形成。另有研究表明，載脂蛋白E與外泌體和腔內囊泡的膜結合是色素細胞中淀粉樣纖維形成的重要調節因素[32-33]。外泌體與載脂蛋白E的這種關聯也促使研究者重新考慮載脂蛋白E和外泌體在AMD中的作用，因為載脂蛋白E是玻璃膜疣的重要組成部分。

2.3外泌體與免疫反應 眼睛作為一個獨特的視覺感覺器官，一直為一個免疫赦免位點，防止免疫原性炎癥的發生[34]。然而有研究表明，在AMD的發病過程中，除RPE退化變性外，免疫反應也參與其中[35]。補體系統是天然免疫的主要組成部分，也是AMD發病機制的關鍵組成部分[36]。CFH基因編碼因子H(factor H，FH)及其較小的剪接變異體因子H相關蛋白(factor H related protein，FHR)-1，FH是主要的血漿補體調節因子，而FHR-1在布魯赫膜和脈絡膜毛細血管中占主導地位[37]。Sivapathasuntharam等[38]研究發現，CFH基因敲除(CFH-/-)小鼠出現明顯的視網膜病變和脈絡膜部分塌陷，故認為CFH不僅是影響視網膜發育的重要因素，而且CFH-/-小鼠視網膜發育異常也可能作為AMD發生的病變基礎。研究表明，FHR-4在脈絡膜毛細血管、布魯赫膜和玻璃膜疣中聚集，隨著FHR-4的不斷累積，引起補體過度周轉，最終導致循環免疫細胞的激活和募集，而該現象也是早期AMD的一個關鍵特征。

Wang等[30]發現，外泌體標志蛋白CD63與CFH在AMD患者的玻璃膜疣中共表達，且CFH以一種劑量依賴性方式與RPE分泌的外泌體結合，故他們認為由C3包裹的外泌體很有可能是CFH的作用靶點。關于AMD中外泌體與免疫反應之間的關系目前尚不清楚，未來需進一步研究。

2.4外泌體作為AMD診斷的標志物 外泌體作為理想的生物標志物具有以下特征：①外泌體的脂質雙分子層可以為其內容物提供保護；②外泌體的內容物由組織、細胞和疾病特異性蛋白質或核酸組成；③外泌體性能穩定，從體液中分離和富集的方法多樣[11]。從RPE的基底側釋放的外泌體可通過脈絡膜進入全身循環，因此可能成為血液中視網膜疾病生物標志物的潛在來源[39]。

為了尋找與AMD發生發展相關的分泌性生物標志物，Kang等[40]對來自RPE條件性培養基、條件性培養基以及AMD患者房水外泌體中的蛋白質進行了比較，結果發現多種蛋白質在視網膜色素上皮細胞系ARPE-19外泌體和AMD患者房水外泌體中均表達，排除其他可能分泌外泌體的細胞(Müller細胞和視網膜神經節細胞)外，認為RPE可能是AMD患者房水中外泌體的主要來源，因此房水中的外泌體可作為AMD的生物標志物。

在AMD的發病機制中，許多miRNAs與細胞增殖、遷移、凋亡和新生血管形成相關。Elbay等[41]研究發現，與對照組相比，濕性AMD組患者血清中的miR-486-5p和miR-626明顯高表達，而miR-885-5p 表達明顯下調。因此推斷，這些miRNAs在濕性AMD中的特異性表達可能成為診斷和評價AMD的一種新生物標志物。

2.5外泌體與AMD的治療 對于濕性AMD，目前臨床常用的治療方法為玻璃體腔內注射抗血管生成藥物，但這種給藥方式會產生一些并發癥，如結膜下出血、感染性眼內炎、玻璃體積血等，因此提高注射安全性一直是玻璃體腔內注射抗血管生成藥物的研究重點[42]。Hajrasouliha等[26]通過對CNV小鼠結膜下注射RAC源性外泌體發現，結膜下注射外泌體可以使藥物從結膜快速運送至脈絡膜和視網膜。該結果提示，結膜下外泌體注射或許是一個更為安全有效的給藥方式。

α-晶體蛋白是小熱激蛋白家族的主要成員，在RPE的胞質和線粒體中表達，在氧誘導的視網膜病變和發育過程中受到調節。此外，α-晶體蛋白可保護RPE免受氧化應激和內質網應激誘導的損傷和自噬。同時，α-晶體蛋白也是血管生成因子和血管內皮生長因子的調節因子，通過外泌體途徑分泌。而α-晶體蛋白衍生的伴侶蛋白可防止氧化劑誘導的細胞死亡，因此對AMD具有治療潛力[43-44]。

CFH是由RPE產生的一種補體因子，有助于C3轉化酶的衰變，防止C3b沉積的擴增。研究表明，CFH的變異體對AMD新生血管的治療有較好的反應[45]。Cashman等[46]研究發現，C3誘導的小鼠視網膜病變能夠被CFH的表達所抑制。因此，CFH的表達作為一種潛在的AMD基因治療手段值得進一步研究。

3 小 結

AMD作為一種不可逆性的老年性致盲眼病，為患者及其家屬帶來極大負擔，手術治療以及抗血管內皮生長因子治療等方法雖然有一定的療效，但仍存在并發癥、療效不佳等問題。外泌體作為一種天然載體，可將一種細胞的蛋白質、核酸等轉運到另一種細胞中，因此可作為靶向治療的理想載體，但這種效應目前主要應用于腫瘤領域，在眼科疾病中應用較少。眼科來源的外泌體通過攜帶脂質、核酸、蛋白質等多種物質發揮細胞間信號轉導、免疫調節作用，或作為藥物載體，為AMD的診斷和治療提供新思路，但其具體作用機制還需進一步研究。