E3 泛素連接酶CUL2 在宮頸癌中的研究進展

張宏蕾，趙衛紅

泛素化是蛋白質在翻譯后的重要修飾之一，是蛋白質被降解前的信號，即需要被降解的蛋白質會先被泛素化標記，形成泛素-蛋白質復合體，之后再被26S 蛋白酶體降解[1]。在這個生物過程中需要E1泛素激活酶、E2 泛素轉移酶和E3 泛素連接酶來完成。泛素連接酶復合體（cullin-ring ligase，CRL）是體內最大的E3 泛素連接酶家族成員，蛋白通過識別受體底物形成復合物，發揮泛素化蛋白質降解作用[2-3]。在大多數癌癥中下調的腫瘤抑制因子希佩爾-林道（von Hippel-Lindau，VHL）因子是一個在缺氧信號轉導與致癌途徑中重要的分子，通過與E3 泛素連接酶復合體形成復合物調節其底物，CUL2 蛋白因主要識別VHL 受體底物，參與形成E3 泛素連接酶復合體，曾被學者們預測為腫瘤抑制蛋白。然而近年研究顯示，CUL2 在宮頸癌、腎透明細胞癌、胃癌、肝細胞癌、食管癌等惡性腫瘤中以發揮促癌作用為主，現對CUL2在惡性腫瘤尤其是宮頸癌中的作用及其機制進行綜述。

1 CUL2 概述

現已知，Cullin 家族有7 個成員，分別為CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5 和CUL7[4]。而在人類、狗、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅和秀麗隱桿線蟲中表現出保守性的CUL2 基因是Cullin 家族中不容忽視的一員。CUL2 是由745 個氨基酸組成Cullin家族中的成員之一，由Cullin2 基因編碼，位于人類第10 號染色體（10p11.21），分子質量約87 ku，等電點為6.46。Cullin 參與泛素復合體的組成，為泛素連接酶E3 提供疏水蛋白骨架，具有高度保守性，并幾乎存在于所有真核生物。在CRL 中表型最好的泛素連接酶是SCF（Skp-Cul1-F-box）和ECS（EloCCUL2/5-SOCS-box），因CUL2 有與環指蛋白1（Ringbox 1，RBX1）相互作用的羧基（C）末端，RBX1 會招募E2 泛素轉移酶，發揮連接Cullin 與E2 的作用；另一端氨基（N）末端則會與延長蛋白（ElonginB/C）相互作用，起到接頭蛋白的作用，使CUL2 與底物受體結合[5]。這些可以與ElonginB/C 連接的底物受體都含有一個特殊的結構域——VHL 盒，有趣的是，起初VHL 被認為是SOCS 盒蛋白，但后來發現VHL缺乏SOCS 盒中的C 末端[6]。VHL 盒由BC 盒（負責與ElonginB 和C 結合）和CUL2 盒（負責與CUL2 結合）構成，隨著對VHL 盒研究的深入，發現含有這個同源性結構域的蛋白很多，如VHL、富含亮氨酸重復蛋白1（leucine-rich repeat protein 1，LRR-1）和性別決定蛋白FEM1，除此之外的更多底物識別位點被發現，底物識別的更多方面被闡明，深入了解CUL2 與其底物之間的關系為癌癥研究開辟了一個新的領域。

2 CUL2 與宮頸癌

眾所周知，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌發生的必要因素，以HPV16 最為多見，保守的E7 癌蛋白是HPV16 致癌的關鍵，E7 癌蛋白靶向視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）使宿主細胞順利進入S 期，并促進上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和細胞遷移[7-8]。最近的研究表明，CUL2 參與了E7 介導HPV16 感染的宮頸癌細胞中pRb 的降解，CUL2 在HPV16 基因型的感染中可能扮演著不同于其他高危型HPV 的角色。HPV16 E7和CUL2 結合通過泛素蛋白酶體依賴的機制使pRb的穩定性和穩態下調[9]，而細胞周期的G1/S 調控點正是pRb 發揮作用的時間點，若pRb 被病毒干擾不能與轉錄因子（E2F transcription factor 1，E2F1）結合，細胞則會順利進入S 期進行增殖，病毒也就可以利用這個時機進行DNA 復制，從而促進宮頸癌的發生發展[10]。研究表明利用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術敲除CUL2 基因會使pRb 呈穩定的高表達，因此CUL2 被反向證明是宮頸癌變過程的關鍵分子[11]。近年研究發現在HPV16 陽性的宮頸癌細胞中，CUL2 受微小RNA-424（miR-424）和miR-154調控，從而參與HPV16 誘導的宮頸癌變[12-13]。

此外，高危型HPV 癌蛋白E7 有延長人角質形成細胞和載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3，APOBEC3）半衰期的作用，APOBEC3 蛋白是一種淋巴免疫細胞的蛋白質，具有廣譜的抗逆轉錄病毒作用[14]。其中APOBEC3 家族中的A3A 是一種專門針對和限制外來DNA 分子的蛋白，可促進外源DNA 分子的分解和代謝[15]，也正是由于A3A 的穩定是CUL2 與E7 蛋白結合基序中的某些殘基所介導，因而做出了E7-CUL2 復合物可能調節A3A 水平的假設，結果如預計的那樣，HPV16 E7 的表達阻止蛋白酶體依賴的A3A 蛋白降解來穩定人角質形成細胞中A3A 蛋白的水平。因為一些在HPV16 E7 的影響下穩定的蛋白質都是通過CRL2自然降解的，說明A3A 蛋白的異常穩定是由于CUL2的功能結構域被E7 蛋白所占據而導致A3A 不能如期降解，這種異常的A3A 蛋白穩定活性可以激活DNA損傷反應[16]，HPV 的DNA 復制又依賴于宿主細胞的DNA 損傷反應，這也是HPV 從該機制中獲得的另一有利生存的條件。

3 CUL2 促腫瘤發生的可能作用機制

3.1 促進腫瘤血管生成 VHL 綜合征表現為一系列病變，包括腎細胞癌、中樞神經系統或視網膜的血管母細胞瘤和嗜鉻細胞瘤[17]，多因為VHL 腫瘤抑制蛋白的BC 盒發生了突變或表達缺失所引起[18]。Cai等[19]在研究miR-21-5p 在宮頸癌中的過表達時，發現了VHL 的mRNA 序列上3′非翻譯區是miR-21-5p的直接靶點，miR-21-5p 通過下調VHL 促進宮頸癌的轉移。CUL2 是VHL 抑癌復合物的組成成分，而大多數致病性突變的VHL 會抑制ElonginB/C-CUL2-VHL抑癌復合物的形成，因此探索CUL2 在該復合物中的作用與其生物效應顯得尤為重要。VHL 在正常氧氣量的生理狀態下靶向缺氧誘導因子1α（HIF-1α），HIF-1α 是一種可介導缺氧敏感基因表達的轉錄因子，在機體缺氧反應時發揮作用，經典途徑是介導缺氧敏感基因血管內皮生長因子的表達上調，促使血管的生成。Guo 等[20]發現HPV E6 癌蛋白可以阻斷VHL 與HIF-1α 結合，阻礙HIF-1α 的降解，穩定堆積的HIF-1α 誘發瓦伯格效應（Warburg effect），葡萄糖更多地轉運到腫瘤細胞，形成了適宜的腫瘤微環境，HIF-1α 被認為是調節多種腫瘤發生的信號分子和轉錄因子活性的信號樞紐。此外，CUL2 小干擾RNA（siRNA）會抑制芳香烴受體核轉運體的表達來調節HIF，該轉運體可與內源性HIF-1α 形成異源二聚體。而異位表達的芳香烴受體核轉運體在內皮生長因子的啟動子中可逆轉CUL2 siRNA 對HIF 活性的抑制。盡管在VHL 與CUL2 組成的泛素連接酶復合體中，CUL2 的N 末端延伸可與VHL-ElonginB/C相互作用，但是研究發現在缺乏VHL 的786-O 細胞中，CUL2 siRNA 同時抑制了芳香烴受體核轉運體和內皮生長因子的表達，表明CUL2 可以獨立于VHL 調節HIF 活性，證明CUL2 對于正常血管生成的驅動過程是必不可少的生物分子。由此看來，VHL 可招募CUL2 E3 泛素連接酶泛素化并降解HIF-1α，HIF-1α有激活血管和紅細胞生成過程的基因轉錄作用，所以有學者指出若是可以抑制HIF-1α 的降解以增加促紅細胞生成素的產生，則可作為治療缺血和慢性貧血的新療法。CUL2 之所以被預測為腫瘤抑制蛋白，是因為其與VHL 基因和HIF-1α 的泛素化降解有關，且CRL2 VHL 的底物多樣性使得E3 泛素連接酶復合體具有了功能多樣性[21]。

3.2 調節細胞動力 根據氨基酸序列分析，不同蛋白質中的VHL 盒不但相似而且高度保守，擁有這種結構域的富含亮氨酸重復蛋白1（LRR-1）是CRL2復合體（CRL2LRR-1）的核底物識別亞單位[21]，其結構域中同樣含有BC 盒和CUL2 盒，這樣獨特的結合基序在體內與體外都被證明發揮了與CUL2 結合的功能。CUL2LRR-1 是細胞動力的關鍵調節者，人類CUL2LRR-1 通過阻止細胞質中的p21 抑制Rho/ROCK/LIMK 通路以促進細胞靜止狀態，是細胞運動的關鍵調節因子。且人類LRR-1 是絲切蛋白的負向調節因子，絲切蛋白是一種肌動蛋白結合蛋白，介導了細胞內的多種信號通路，絲切蛋白的激活會導致片狀偽足的形成[22]，影響腫瘤細胞的運動，進而增強或減弱腫瘤細胞的遷移與侵襲。目前，已在宮頸癌、肝癌、結腸癌、胃癌及腎癌的浸潤性腫瘤細胞中檢測到絲切蛋白表達上調[23]。

3.3 誘導腫瘤免疫逃逸 黑色素瘤特異性抗原（preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME）也是擁有特異VHL 盒的蛋白質，其是在1例黑色素瘤患者體內被鑒定為發生自體抗腫瘤免疫反應的特異性抗原，目前PRAME 被認為在人體正常組織中不表達，在血液系統腫瘤、乳腺癌和腎癌等惡性腫瘤中過度表達，并且被證明與黑色素瘤病變分期有關，與神經母細胞瘤、漿液性卵巢瘤患者的預后有關，在臨床上高水平的PRAME mRNA 是乳腺癌患者預后不良的因素[24-25]。值得注意的是，這種腫瘤抗原上亦存在VHL 盒，VHL 盒在PRAME 蛋白的N-末端，成為PRAME 與CUL2 的中間媒介，提示PRAME 在發揮生物效應時很可能就是借助了E3 泛素連接酶中重要的組成成分CUL2，也就是說這種癌蛋白的致癌性與泛素化存在著功能性聯系。染色質免疫共沉淀-高通量測序（ChIP-Seq）顯示PRAME經常占據轉錄活性啟動子區域，該區域也被核轉錄因子Y（nuclear factor Y，NFY）結合，包括NFY A和NFY B，NFY 是促進早期胚胎發育、細胞增殖的重要轉錄因子[25]。而且具有降解性的NFY A 突變體可以促進細胞增殖，這與惡性腫瘤的發生有著一定的因果關系。研究發現，PRAME 被特異性地招募到具有轉錄活性的NFY 啟動子中，PRAME 的結合可預測NFY 基因座是否具有活性，因此PRAME 在轉錄調控中的作用不容小覷[25]。PRAME 的其他潛在底物仍有待確定，隨著未來更多底物的揭示，PRAME 與CUL2 的合作關系及其在多種類型的人類癌癥中作為潛在癌基因的分子機制也將會被揭曉。

3.4 調控細胞增殖 可對CUL2 起修飾作用的類泛素蛋白NEDD8 修飾Cullin 亞基中單個保守的賴氨酸殘基，改變C 末端環結合域的構象結構，由此決定了相應CRL 的激活與否，構象開放的CRL 方便了與底物的結合[26-27]，CRL 的識別底物是一些調節細胞功能的關鍵分子，CRL 被認為是潛在的抗癌靶點，因此NEDD8 激活酶作為NEDD8 結合途徑的重要組成部分極其重要。目前發現，NEDD8 激活酶抑制劑可解除其對細胞周期S 期DNA 合成的調控，值得慶幸的是，一種NEDD8 激活酶抑制劑MLN4924 可使CRL失活，表現其抗癌活性[28]，NEDD8 激活酶抑制劑可阻斷Cullin 環類泛素化修飾，導致CRL 底物的積累并誘導腫瘤細胞凋亡。由于泛素-蛋白酶系統的抑制劑對治療癌癥有所幫助，且抑制NEDD8 激活酶通路比抑制蛋白酶體活性能更有選擇性地破壞癌細胞蛋白質的穩態，從臨床療效的角度講，這種療法具有更高的可行性[29]。

腫瘤抑制因子Ras 同源物家族成員B（Ras homolog family member B，RhoB）通過調節多個下游效應器來控制多種與癌癥相關的重要信號通路，RhoB 在肝癌組織中表達下調，且通過蛋白質組學的分析，RhoB 被認定為Cullin-RBX1-E3 連接酶的一種底物，被NEDD8 耦聯激活后的Cullin-RBX1-E3連接酶與RhoB 相互作用，促使這種腫瘤抑制因子的泛素化和降解，RhoB 并不是與任何一個Cullin 家族的蛋白都可發生上述效應，內源RhoB 僅與CUL2相互作用。人肝癌組織中過表達的RBX1 與CUL2一起作用于RhoB 使其降解，可以說CUL2-RBX1-E3連接酶是肝癌中RhoB 的調節器，在人肝癌組織中Neddyling-CRL 途徑的過度激活與RhoB 水平呈負相關，反過來說明了RhoB 被泛素化降解是部分導致肝癌發生的原因[30]。目前研究證實了MLN4924 會抑制NEDD8 對CRL2 的耦聯，使CRL2 失活，從而導致CUL2 對RhoB 的泛素化作用下調，RhoB 的積聚會觸發細胞凋亡，抑制肝癌細胞的生長。

3.5 調控EMT Twist 是一種關鍵的促EMT 的轉錄因子，可上調間充質細胞表型相關的基因蛋白——波形蛋白（Vimentin）表達，EMT 是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。通過結合位點分析，Twist1 可結合CUL2的啟動子，啟動其環狀RNA（circ10720）的轉錄[31]，導致了CUL2 circ10720 的異常形成，但不促進mRNA表達，circ-10720 可以海綿吸附調控波形蛋白的miRNA，使波形蛋白也異常表達[31-32]，而波形蛋白正是EMT 間充質細胞的重要標志物。Twist1 通過增加可吸收波形蛋白miRNA 的circ10720 來上調波形蛋白水平這個環節，可能就是circ10720 肝癌細胞中circ10720 與Twist1、預后不良、腫瘤惡變程度呈正相關的原因。有研究報道，在體外和患者來源的異種移植瘤和二乙基亞硝胺誘導的Twist1 轉基因小鼠肝癌模型中，circ10720 基因敲除能消除Twist1 的促瘤活性[31]。此外，還利用熒光素報告系統驗證Twist1 過表達增加了CUL2 啟動子活性，而Twist1 的基因敲除降低了CUL2 啟動子活性，正反雙向的實驗驗證了Twist1在EMT 過程中調節波形蛋白的機制。CUL2 circ10720在轉移性肝癌和甲胎蛋白陽性組的肝癌組織中呈顯著性持續增高，為肝癌的治療提供了潛在的治療靶點，將會是一種新的診斷和治療策略。汪雯雯等[33]在研究中表明Twist 通過誘導EMT 參與了宮頸癌發生的整個過程，并與宮頸鱗狀上皮細胞癌抗原淋巴結轉移呈正相關。Babion 等[34]研究發現，宮頸癌中有雙重作用的miR-9-5p 的靶點之一是EMT 的轉錄因子Twist1。

4 結語與展望

CUL2 蛋白在一系列富含VHL 盒受體底物的泛素化過程中起著決定性作用，其中備受關注的VHL基因在宮頸鱗狀細胞癌與非癌組織中呈現了不同的狀態，Choi 等[35]檢測發現VHL 在宮頸鱗狀細胞癌中甲基化，超甲基化的腫瘤抑制基因表達沉默參與了宮頸癌的發生。CUL2 與VHL、ElonginB、ElonginC 形成的ElonginB/C-CUL2-VHL 復合物在腫瘤的發生發展中發揮關鍵的抑癌作用，在宮頸癌中又表現出促癌作用，尋找調控CUL2 的機制成為了阻斷惡性腫瘤發生發展的關鍵點，如有文獻報道miR-574-3p可以通過靶向調節CUL2 成為治療胃癌和膀胱癌的新靶點[36-37]。鑒于CUL2 作為HPV16 E7 降解抑癌蛋白pRb 過程中的關鍵分子，相信未來隨著對CUL2的進一步研究，CUL2 有望成為判斷宮頸癌發生和預后的分子標志物，并為阻斷宮頸癌的發生提供新靶點。