GAS6/TAM信號通路在止血和血栓形成中的作用研究進展

謝崧璞，劉承云

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院老年病科，武漢 430022)

2010年全球死亡人口中有1/4死于血栓栓塞性疾病及血栓形成的并發癥[1]。血栓栓塞根據形成部位不同可分為動脈栓塞和靜脈栓塞。動脈血栓形成主要導致缺血性心臟病和缺血性腦卒中；靜脈血栓形成包括深靜脈血栓形成，最常累及下肢和肺部[1-2]。因此，血栓形成作為缺血性心臟病、缺血性腦卒中以及靜脈血栓栓塞癥的共同潛在機制，是全球死亡的主要原因。在中國，缺血性心臟病的致殘率高達(113～128)/10萬，且缺血性腦卒中造成的最大傷殘調整壽命年最高[1]?？寡“迨悄壳爸委熝ㄐ约膊〉闹饕椒ǎ虺鲅头磻嬖趥€體差異而導致應用受限[3]。因此，亟須尋求更安全、有效的治療方式。TAM家族的受體酪氨酸激酶及其配體[包括生長停滯特異性基因6(growth arrest-specific gene 6，GAS6)和蛋白S]是調節血栓形成和止血的一條旁路途徑。抑制GAS6/TAM信號通路可降低血小板活化反應并保護小鼠避免形成動脈和靜脈血栓，且不會增加出血風險，故有望成為新型抗血小板藥物的治療靶點。此外，GAS6/TAM信號通路也在多種良性和惡性細胞中表達，作用包括調節炎癥、吞噬凋亡細胞和細胞碎片、穩定血小板、維持血管平滑肌動態平衡、生精、維持視網膜在位和促進癌癥進展[4-5]?，F就GAS6/TAM信號通路在止血和血栓形成中的作用予以綜述。

1 GAS6與其受體TAM家族

1.1GAS6 GAS6是一種旁分泌型維生素K依賴性蛋白質，在小鼠成纖維細胞中發現，其在細胞G0期表達，經傳代培養后GAS6的表達下調[6]。隨后有學者發現，GAS6在多種人類細胞(血管平滑肌細胞、系膜細胞、內皮細胞、骨髓基質細胞、巨噬細胞)[7]血小板和血漿中表達[7-8]，并參與調控生長調節相關的蛋白酶級聯反應[9]。脈管系統中，細胞分泌GAS6主要受部分血小板受體激動劑(如凝血酶、膠原蛋白、紅細胞生成素)以及促炎細胞因子轉化生長因子-β的刺激[10]。

GAS6/TAM信號通路的其他成分也較活躍，可能參與“血栓炎癥”這一病理狀態。GAS6水平在炎癥(敗血癥、全身炎癥反應綜合征、系統性紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化)條件下升高，而GAS6普遍表現出抗炎作用，通過下調腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、γ干擾素以及細胞間黏附分子1的表達，在維持免疫穩態中發揮重要作用[6-10]。除阻斷血小板的激活、保護小鼠避免形成血栓外，抑制GAS6在小鼠體內的表達也可防治肝臟炎癥、脂肪性肝炎和肝纖維化[11]。但在小鼠中，GAS6增加了結腸炎相關腫瘤的發生[12]。

GAS6蛋白主要與TAM家族血小板表面受體酪氨酸的C端性激素結合球蛋白結合，其中性激素結合球蛋白由兩層粘連蛋白G域組成[13]。這種結合觸發了TAM受體的二聚作用和自身磷酸化[14-16]，并隨后激活下游信號分子磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)[17]、Rap1和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)。而PI3K/Akt的激活會導致β3整合素胞質尾部的磷酸化，促進一種“由外向內”信號的傳播和擴增[18]，導致血小板構象改變、血塊收縮以及隨后的血小板栓穩定。

1.2其他配體 除GAS6外，還有其他已知的配體可以激活TAM受體，包括蛋白S、桶狀樣蛋白1和重組人半乳凝素-3。其中GAS6和蛋白S均是維生素K依賴性蛋白，約43%的氨基酸序列同源和蛋白分子結構域相同[19]。蛋白S已被證明能夠與Tyro3受體和Mer受體結合[20]，但尚未發現其與Axl受體有親和力。桶狀樣蛋白1通過Mer實現促進視網膜色素上皮細胞和巨噬細胞吞噬的作用[21]。半乳凝素-3是一種Mer特異介導的“吞噬我”信號，可刺激巨噬細胞和視網膜色素上皮細胞吞噬凋亡細胞、細胞碎片，且半乳凝素-3在心肌梗死組織損傷后或急慢性肝損傷中也會上調[21]。

1.3TAM受體家族 TAM受體酪氨酸激酶包括Axl、Tyro3和Mer。GAS6與TAM受體結合的親和力不同，其中與Axl結合的親和力最高，Tyro3的親和力與Axl相似，與Mer結合的親和力最低[4]。在許多類型的細胞中均能找到單個TAM受體的表達，但在不同組織中Axl、Tyro3和Mer的表達不同。Tyro3主要見于中樞神經系統、腎臟、卵巢和睪丸；Axl大部分存在于造血、上皮和間充質來源的細胞中；Mer主要表達于卵巢、睪丸、前列腺、肺和腎臟，少量表達于胸腺、脾、肝、小腸、結腸和胎盤[22]。

GAS6結合并促進TAM受體家族中單個跨膜酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化[23]。研究表明，Mer是血小板(無論是人還是鼠)上唯一檢測到的GAS6受體[24]，但有研究使用免疫電鏡檢測到血小板中也存在Axl，并標記出血小板激活后位置的改變[25]。目前，關于TAM受體家族在血小板中表達方面還尚未達成共識，血小板主要表達Mer還是Axl有待進一步研究證實。

2 GAS6/TAM信號通路在止血和血栓形成中的分子機制

當血小板暴露于von Willebrand因子、膠原蛋白、凝血酶、血栓素A2、ADP等時可導致血小板活化和隨后的血小板聚集，這一動態過程稱為“由內到外”的信號轉導。這一過程涉及快速接觸激活的細胞表面受體，信號轉導通路涉及Src家族激酶、PI3K/Akt和免疫受體酪氨酸激活基序信號通路，最終導致細胞內鈣動員、纖維蛋白原受體轉變和整合素αⅡbβ3從不活躍的低親和力構象轉變為活躍的高親和力構象的過程。相反，GAS6/TAM信號通路則是通過一種“由外向內”的信號間接激活血小板，3種TAM受體均位于血小板表面，介導血小板的形成和穩定[13]。

血漿GAS6的水平對血小板無影響[26]，GAS6是通過調節由整合素αⅡbβ3介導“由外向內”的信號，增強并擴大了由ADP及其他激動劑所觸發的血小板激活反應[17,25]。研究表明，GAS6在人類血漿中的水平存在個體差異(15～65 μg/L)[25,27]，血漿GAS6水平與血小板活化程度無明顯相關性，且在人類血小板中未發現生理性相關的高水平GAS6信使RNA和蛋白[27]，而是以低水平(20 μg/L)存在[17,25]。

基于整合素αⅡbβ3在血小板功能中的關鍵作用，結合整合素αⅡbβ3的配體抑制劑已用于預防血栓形成。GAS6重組抗體可以阻止纖維蛋白原與整合素αⅡbβ3綁定，從而阻斷GAS6正向調節整合素αⅡbβ3介導的血小板聚集這種“由外向內”的信號。目前，所有的抗血小板藥物均是一種“由內向外”信號的特定抑制劑，如阿司匹林抑制環加氧酶1，從而抑制血栓素A2的產生；氯吡格雷通過P2Y12受體拮抗信號轉導。目前，大部分藥物均抑制血小板聚集形成，還沒有針對防止血小板不可逆性聚集的藥物。因此，通過抑制GAS6/TAM信號通路以調控血小板不可逆聚集可能是治療血栓性疾病的一個新方向。

3 GAS6或TAM受體基因缺失所導致的生物學效應

目前，關于Tyro3/Axl/Mer受體的單基因、雙基因和三基因敲除以及GAS6敲除(GAS6-/-)小鼠止血的生理功能已得到廣泛研究。GAS6-/-小鼠表現出正常的生長過程，凝血因子水平和凝血時間均在正常范圍內，表現出正常血小板、巨核細胞計數以及正常血小板超微結構形態，且未發生自發性出血或血栓形成[17]。與野生型小鼠相比，GAS6-/-小鼠免避免了血栓形成的風險，血小板在流動環境中形成了更小的聚集物(這一過程可通過添加人重組GAS6蛋白而逆轉[25])[17]。對GAS6-/-小鼠血小板聚集的研究揭示了在低水平激活劑[ADP 2.5～10 μmol/L、膠原蛋白2 μg/mL、U46619(血栓素A2模擬物)10 μmol/L]的刺激下，盡管GAS6-/-小鼠的血小板與野生型小鼠相比表現出了正常的構象變化，但聚集反應減弱，未達到與野生型小鼠相同的程度；而激動劑水平較高(ADP 50 μmol/L、膠原蛋白5～15 μg/mL和U46619 100 μmol/L)時，GAS6-/-小鼠與野生型小鼠的不可逆性聚合程度相當[17]。以上研究提示，所有劑量的凝血酶在野生型和突變型小鼠體內均能刺激血小板聚集，但GAS6-/-小鼠的血小板表現出激動劑劑量依賴性的聚集反應。超微結構分析顯示，與野生型小鼠相比，GAS6-/-小鼠的血小板聚合松散不密集，為不完全脫粒，且與周圍血小板之間的連接更少[23]。

任何一種GAS6受體缺陷，即Tyro3-/-、Axl-/-或Mer-/-小鼠，在基線條件下均未發生自發性出血或血栓形成，但出血模型中每種小鼠均在短暫止血后有反復出血的傾向，表現為失血量逐漸增多[23]。與野生型小鼠相比，Tyro3-/-、Axl-/-、Mer-/-3種基因缺陷小鼠的血栓形成發生率平均降低90%以上或未發生肺栓塞[23]。但Tyro3-/-、Axl-/-、Mer-/-3種GAS6受體缺陷小鼠的血小板計數、凝血酶原時間和活化部分凝血活酶時間或纖維蛋白原水平均相同，表明小鼠自發性出血或血栓形成與基因型無關[23]。

雖然GAS6或TAM受體基因缺失小鼠有反復出血的傾向，但目前尚無證據表明有嚴重的出血性不良反應。因為GAS6/TAM信號通路并不是血小板的主要激活通路，這一信號轉導級聯反應本身并不會使血小板活化，而是加強其他激動劑啟動的激活過程[17,25,28]，因此抑制GAS6/TAM信號通路具有溫和的抗血小板、抗血栓形成作用。另外，上述3種TAM受體中任意一種的基因缺陷均會導致另外兩種表達明顯減少，還會導致由GAS6刺激所產生的纖維蛋白原介導的血小板連接和血小板活化能力減弱[23]。

與單受體缺失小鼠相似，3種TAM受體基因均缺失的轉基因小鼠血小板功能受到抑制，這些小鼠有復發血栓和反復出血的傾向[29]，出現血小板減少和止血功能受損，此外還表現出炎癥或自體免疫亢進，產生抗磷脂抗體，脾腫大、睪丸小以及精子發生缺陷等[30]。

4 抑制GAS6/TAM信號通路產生的效應

4.1GAS6抗體抑制血小板功能 研究表明，GAS6特異性抗體能有效作用于GAS6蛋白結構中負責將其與受體結合的C端，從而抑制血小板的活化[13]。有研究通過膠原/腎上腺素觸發體內血栓栓塞，與陽性對照的內參抗體相比，GAS6中和抗體對ADP激活的人洗滌血小板的聚合反應產生了劑量依賴性的阻斷作用，這種阻斷作用在無ADP存在的情況下對血小板的聚合無影響，但提高激動劑的劑量時可被逆轉[31]。由于未添加重組GAS6，可以確定GAS6特異性抗體阻斷了從血小板中釋放的GAS6刺激血小板活化聚集的作用[17,31]。用GAS6抗體做預處理的小鼠與GAS6-/-小鼠均未出現膠原/腎上腺素觸發的致命血栓(存活率為75%～80%)，且均無證據顯示出血風險增加；而陽性對照的內參抗體在預防野生型小鼠致死性血栓栓塞方面無效[17]。

4.2TAM受體特異性的小分子抑制劑 有研究報道，Mer受體特異性小分子抑制劑UNC2025和UNC2881可抑制Mer的活性，而抑制Mer磷酸化和下游Akt、Src的激活可干擾后續信號通路的轉導，減少血小板活化，保護小鼠免于致命的肺栓塞和動脈血栓形成，且不增加出血次數，有作為抗血小板治療藥物的潛能[32-33]。在膠原/腎上腺素模型中，這些Mer受體特異性的小分子抑制劑可預防小鼠出現血栓栓塞，氯化鐵損傷后頸動脈平均通暢時間明顯增加，雖然經Mer受體特異性的小分子抑制劑處理后的小鼠未顯示出自發性出血，但血小板活化反應減弱，表面活化標志物減少，以及生理流動條件下形成的聚集物穩定性降低[28]。聯合使用UNC2025和ADP/P2Y1/P2Y12這兩種抑制機制不同的通路拮抗劑時，抗血小板作用明顯增強，并呈現出非線性疊加[33]。同時，對于GAS6/TAM信號通路與ADP/P2Y1/P2Y12受體的聯合拮抗也可減少抑制劑的劑量[33]。有文獻報道，整合素αⅡbβ3介導的“由外向內”信號激活是維持血小板聚集過程中需要經過的一種“晚期”信號通路，由血液淤滯、激活劑誘發的血小板聚集能夠在ADP/P2Y1/P2Y12被抑制的情況下逆轉，導致形成單一、無法與纖維蛋白原綁定的血小板[34]。高劑量UNC2025治療的不良反應主要為貧血和白細胞減少，但這些不良反應不是與劑量有關的毒性作用，可能是由于骨髓腔內對UNC2025敏感的FMS樣酪氨酸激酶3受抑制而產生的不良反應[34]。未來需進行更廣泛的研究以評估Mer抑制對炎癥、感染和自身免疫產生的影響，以評估長期使用UNC2025治療的潛在后果。

5 小 結

GAS6/TAM信號通路是一種潛在的治療靶點，若切斷、抑制該信號通路，并聯合拮抗ADP/P2Y1/P2Y12通路，可抑制血小板活化、降低血小板聚集的穩定性、預防血栓形成，未來可能被運用于臨床一些必要降低出血風險的短期治療，如易產生血栓的外科手術、肺靜脈血栓消融術、支架置入等，而應用于缺血性心臟病及缺血性腦卒中等心血管事件后的長期抗血小板治療仍有待進一步討論。雖然GAS6/TAM拮抗劑對血小板活化的抑制和對血栓形成的保護作用有積極意義，但也應謹慎應用。除高濃度UNC2025所產生的不良反應外，研究所用到的小鼠尾部出血止血模型對于臨床應用的參考價值也有限[35]，且可能低估了由某些化合物所導致的出血風險，如抗凝血因子Ⅷ的治療性抗體LE2E9在動物模型中未增加出血風險，而在受一定控制前提的人類治療性試驗中產生了出血傾向[36]，這種動物模型與人體試驗的差異性應當引起高度重視。與目前的治療策略相比,靶向GAS6/TAM信號通路治療的出血風險更小，因此有必要深入研究其價值，以期為止血和血栓形成疾病的治療提供新方法。