潘氏細胞及其與急性胰腺炎關系的研究進展

伏 揚 曾 悅

急性胰腺炎(AP)患者常伴有腸黏膜屏障功能障礙，小腸細菌移位會加重全身炎性反應。AP患者的腸黏膜屏障功能障礙被認為與腸黏膜的缺血-再灌注損傷、嚴重的氧化應激及細胞凋亡有關。潘氏細胞可分泌多種抗菌肽構成先天免疫的一部分，小腸隱窩中高水平的抗菌肽可抵御病原體入侵。研究發現，潘氏細胞損傷可能在AP全身炎性反應的進展中起著重要作用。本文就潘氏細胞及其與AP關系的研究進展作一綜述，以期為AP的治療拓展思路。

1 潘氏細胞概述

1.1 潘氏細胞的形態

1872年Schwalbel首次描述了存在于利氏腸腺隱窩底部的細胞的形態學特征。約16年后，Paneth用光學顯微鏡重新觀察了這些細胞，并以其名字命名。潘氏細胞呈截短的錐體形狀，頂端有刷狀緣(即微絨毛)突出到隱窩腔中，位于基底的細胞核形狀不規則，核仁發育良好，其特征是位于細胞頂端豐富的嗜酸性顆粒。由于潘氏細胞具有廣泛的內質網和發育良好的高爾基體，故其具有強大的分泌蛋白質的功能，分泌的物質包括α-防御素、溶菌酶、磷脂酶A2和C型凝集素等，其中以α-防御素最為豐富。

1.2 潘氏細胞的產生

潘氏細胞、杯狀細胞、腸上皮細胞和腸道內分泌細胞由隱窩中的腸道干細胞群不斷分化而來。譜系追蹤研究已證明，位于小腸隱窩底部的富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體(LGR5)的細胞是可分化為小腸上皮所有類型細胞(包括潘氏細胞)的干細胞。小腸上皮細胞的壽命較短(3～5 d)，而潘氏細胞的壽命則較長(約30 d)。研究表明Wnt信號通路對于維持腸上皮細胞快速更新非常重要。Wnt信號蛋白激活該通路后，β-連環蛋白(β-catenin)累積并轉移至細胞核，與T細胞因子4(TCF4)結合形成復合物來介導關鍵靶基因的轉錄激活。Wnt信號通路不僅對維持腸道干細胞的功能、控制上皮細胞沿隱窩-絨毛軸的遷移和定位、引導分泌性細胞譜系的早期發展十分關鍵，而且指導著潘氏細胞的終末分化[1-2]。Wnt信號通路激動劑R-Spondin-1可刺激腸道干細胞分化為潘氏細胞，促進潘氏細胞分泌α-防御素[3]。

Wnt信號通路激活的TCF4靶基因包括一些在潘氏細胞發生過程中起重要作用的基因，如SOX9、EPHB2和EPHB3等。Bastide等[4]對腸上皮特異性敲除SOX9基因的小鼠的小腸隱窩細胞進行形態學鑒定和溶菌酶染色，結果表明幾乎所有的隱窩都沒有潘氏細胞，證明SOX9基因是潘氏細胞分化所必需的。此外，細胞受體酪氨酸激酶EphB2和EphB3對潘氏細胞在隱窩中的定位起著重要作用，缺乏EphB3的小鼠中，潘氏細胞散布在整個隱窩和絨毛基底部[5]。除此以外，在缺少FZD5(一種在潘氏細胞中表達的Wnt配體受體)的情況下，未成熟的潘氏細胞會出現定位異常[6]。

潘氏細胞分化過程對Wnt信號通路的依賴性可被其他信號通路(如Notch信號通路)降低。隱窩底部柱狀細胞表達Notch受體，同時潘氏細胞表達相應配體[7]。對Math1基因敲除鼠和GFI1基因敲除鼠的研究表明，分泌性腸上皮細胞的分化依賴于兩條Notch信號通路的下游靶基因Math1和GFI1[8]。另有研究采用苯二氮卓(DBZ)抑制野生型B6小鼠的γ-分泌酶來抑制Notch信號通路，發現全小腸隱窩中分泌性細胞的分化顯著增多，小腸隱窩布滿原位潘氏細胞和轉分化細胞，這些轉分化細胞兼具潘氏細胞和分泌黏液細胞的形態學特征[9]。

2 潘氏細胞抗菌肽的分泌與功能

2.1 抗菌肽的分泌

潘氏細胞抗菌肽(AMP)的生物學功能在一定程度上與受到調控的分泌顆粒有關。顆粒的釋放是對各種刺激的反應，包括膽堿能激動劑、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，以及各種細菌產物(脂多糖和脂磷壁酸)，但不包括真菌和原生動物產物。由于小腸內含有豐富的細菌及其產物，因此潘氏細胞可能以基線速率持續分泌顆粒。

潘氏細胞對細菌入侵的反應是通過一種基于自噬的替代性分泌系統釋放溶菌酶，稱為分泌性自噬，其可由細胞內在機制觸發，沙門氏菌引起內質網應激導致DDIT3/CHOP表達和eIF2AK3/PERK磷酸化，從而磷酸化eIF2A/eIF2，最終溶菌酶被包裝成微管相關蛋白輕鏈3(LC3)標記的雙膜顆粒分泌到腸腔；此外，分泌性自噬也可由細胞外在機制觸發，細菌被樹突狀細胞(DC)通過Toll樣受體(TLR)識別，隨后MYD88信號激活3型天然淋巴細胞(ILC3)，ILC3可分泌IL-22并作用于潘氏細胞，使其通過分泌性自噬分泌溶菌酶[10]。

細菌性和藥物性激動劑所引起的顆粒分泌伴隨著細胞質Ca2+水平升高，由KCNN4編碼的鈣激活鉀通道KCa3.1維持該分泌功能的Ca2+通量[11]。由于顆粒分泌可直接影響小腸腔內AMP的數量和水平，因此對于顆粒分泌的調節最終也會影響潘氏細胞的功能。

2.2 AMP的生物學功能

AMP是免疫系統的重要組成成分，在宿主防御中起著不可或缺的作用。不同于傳統的抗生素(如青霉素等微生物的次級代謝產物)，由基因編碼并由核糖體合成是AMP的主要特征。潘氏細胞是腸道中分泌AMP的主要細胞。

哺乳動物中，防御素是一類重要的AMP，根據半胱氨酸殘基的排序可分為α-防御素和β-防御素兩種，兩者對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有殺菌活性。大鼠和人類的潘氏細胞、中性粒細胞及多種上皮細胞均表達防御素；而在小鼠中，防御素僅在潘氏細胞表達，故又稱為隱窩素，其前體被潘氏細胞所表達的基質金屬蛋白酶7(MMP7)等蛋白酶切割成為成熟的活性肽[12]。人類潘氏細胞中只表達兩種α-防御素HD5和HD6，并且兩者在腸道中差異降解為不同的活性抗菌片段[13]。HD51-9是極具活性的AMP，其對所有被測試的細菌都有抗菌活性；而HD6的功能與HD5存在顯著差異，其被描述為由納米網形成的防御素，這種網狀結構可作為黏膜防御的一部分，在宿主抵抗細菌滲透黏液層的過程中起著關鍵作用[13]。給予小鼠人重組HD5灌胃可減輕乙醇和結腸炎引起的小鼠營養不良和黏膜炎性反應，保護小腸和結腸的上皮完整性，并可防止內毒素移位[14]。2020年的一項研究構建了表達重組HD5的乳酸乳球菌，給予葡萄糖硫酸鈉誘導的結腸炎模型小鼠該益生菌灌胃，結果顯示其可減輕結腸損傷，并可降低炎性細胞因子水平和中性粒細胞浸潤程度[15]。防御素還具有其他活性，如HBD1和HBD2對表達趨化因子受體CCR6的細胞(如DC)具有吸引作用[16]。

溶菌酶在潘氏細胞中高表達，其還大量存在于器官的表面液體及巨噬細胞和中性粒細胞中。溶菌酶是一種可特異性水解肽聚糖的糖苷酶，故表現出對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的殺菌活性。給予小鼠溶菌酶每日灌胃可防止內臟超敏反應期間大腸桿菌的擴增[17]。然而，一些共生菌(如雙歧桿菌)已發展出對溶菌酶的抵抗性，提示病原菌可能也會發展出類似的抵抗性[18]。ⅡA分泌型磷脂酶A2(sPLA2-ⅡA)在潘氏細胞中同樣為組成性表達，并表現出對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的殺菌活性。C型凝集素是一組能與糖類結合的蛋白質，具有糖類識別結構域。人類潘氏細胞中的主要凝集素是REG3α，其小鼠同源物是REG3γ，兩者均能與肽聚糖結合，表現出對革蘭陽性菌的殺菌作用。

3 潘氏細胞與AP

3.1 AP引起腸黏膜屏障功能損傷

與結腸不同，小腸上皮被一層相對多孔的黏液層覆蓋，黏液層松散地附著在腸上皮細胞表面[19]。α-防御素和其他AMP在黏液中富集以增強黏膜屏障功能[20]。AMP和黏液的組合使得腸腔內細菌難以直接作用于腸上皮細胞。此外，由于分泌AMP的潘氏細胞主要位于隱窩基底部，故隱窩腔內的AMP水平較高。因此，黏液AMP屏障可保護腸道干細胞免受細菌侵襲。

AP是常見的需住院治療的消化系統疾病，任何原因引起的胰腺腺泡內胰蛋白酶和其他蛋白水解酶的異常激活都會引發AP，導致胰腺腺泡損傷、促炎介質和細胞因子釋放，以及微循環損傷[21]。研究表明微循環損傷和低血容量可導致腸黏膜缺血-再灌注損傷，繼而導致腸黏膜屏障完整性喪失和腸道菌群移位，從而引發繼發性感染、系統性炎癥反應綜合征(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)和多器官功能衰竭(MOF)。因此，腸黏膜屏障功能障礙是導致AP并發癥發生的主要因素，了解AP時腸黏膜屏障功能障礙的發生機制對于制定有效的預防和治療策略具有重要意義。

在動物模型中，急性壞死性胰腺炎(ANP)可引起小腸細菌過度增殖，其中十二指腸的細菌過度增殖與腸道菌群移位及胰腺感染有關[22]。誘導大鼠發生ANP后，其腸道促炎因子的釋放增加，遠端回腸AMP的分泌減少，這些由潘氏細胞合成分泌的AMP有助于維持腸道菌群的穩態和腸黏膜屏障功能[23-24]。敲除小鼠胰腺腺泡細胞鈣通道蛋白Orai1可減少Cathelicidin相關AMP的分泌，導致小腸和結腸細菌定植增多，腸道通透性增高，細菌移位增多，導致感染率和小鼠死亡率升高；使用抗生素、短鏈游離脂肪酸和合成的Cathelicidin相關AMP可降低腺泡細胞Orai1敲除鼠的死亡率[25]。在雨蛙肽和脂多糖誘導的重癥急性胰腺炎(SAP)模型小鼠中，高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達明顯升高，阻斷HMGB1對腸黏膜屏障功能起到了保護作用，可降低血清中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平，用抗HMGB1抗體阻斷HMGB1可能是改善SAP時腸黏膜屏障功能障礙的有效治療策略[26]。

3.2 潘氏細胞在AP中的變化

AP引起的腸黏膜屏障功能損傷和腸道菌群移位越來越受到學者們的關注，潘氏細胞作為組成腸黏膜屏障的重要環節，其損傷或缺陷已被證明在多種疾病發生中起著關鍵作用，如克羅恩病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、放射性腸病、壞死性小腸結腸炎(NEC)和移植物抗宿主反應(GVHR)等。研究表明潘氏細胞損傷可能是促進AP進展及全身感染的重要因素。Chen等[24]的研究顯示，與假手術組相比，ANP組大鼠胰腺和回腸末端組織的病理損傷及腸黏膜屏障損傷更嚴重，血漿和回腸末端組織中的TNF-α、IL-1β和IL-17A表達升高，潘氏細胞分泌的AMP減少。另有研究發現高三酰甘油血癥(HTG)相關的ANP大鼠的腸黏膜屏障損傷更嚴重，腸道通透性增高，腸道炎性反應更嚴重，且大鼠腸道菌群改變，潘氏細胞分泌的AMP減少，提示HTG可能通過改變腸道微生物群的結構和多樣性，以及潘氏細胞的AMP分泌加重腸道損傷，導致ANP病情加重[27]。

雙硫腙是一種可以選擇性消融潘氏細胞的金屬螯合劑，其逐漸被學者們用于各種研究。Zhang等[28]的研究聯合應用雙硫腙和肺炎克雷伯氏菌誘導出類似于人類NEC的腸道損傷小鼠模型。Liu等[29]的研究顯示，ANP大鼠的潘氏細胞數量減少，分泌功能減弱，小腸損傷加重，菌群移位增多；與ANP組相比，注射了雙硫腙的ANP大鼠的胰腺和回腸末端組織病理損傷更嚴重，回腸組織中炎性因子表達升高，腸道通透性增高，感染率升高，生存率降低，表明潘氏細胞被破壞可能在ANP腸黏膜屏障功能障礙的發展中起著重要作用；此外，該研究還測定了BIP和ATF6的蛋白表達水平，指出ANP時內質網應激可能參與了腸黏膜屏障功能障礙的發生機制，并與潘氏細胞缺失有關。Guo等[30]的研究發現，潘氏細胞耗竭改變了ANP大鼠的腸道微生物群組成，并降低了腸道微生物的多樣性。腸道微生物多樣性變化與ANP病情加重的關聯，以及模型小鼠中上述指標的變化，還需更多的相關研究來證實。

4 總結與展望

潘氏細胞在腸道干細胞功能的維持、腸道微生物組成和宿主防御中起著重要的作用。目前的研究表明潘氏細胞分泌AMP的功能受損和腸道菌群紊亂可能是ANP時發生腸黏膜屏障損傷的原因之一。補充潘氏細胞產物使其功能恢復是潘氏細胞相關研究的常用方法，今后可給予AP小鼠口服或灌胃AMP來探究潘氏細胞功能恢復對AP的可能的保護作用，為臨床上治療AP時的腸道功能紊亂提供新思路，具體分子機制有待應用基因敲除鼠和腸道類器官技術進一步研究闡明。