Notch信號通路與肝癌細胞凋亡關系的研究進展

崔普澤，胡彥建，賀旺，胡彥華

（1.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 普通外科，黑龍江 哈爾濱 150086；2.哈爾濱工業大學附屬哈爾濱市第一醫院 消化內科，黑龍江 哈爾濱 150010）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，高居世界癌癥發病率第5位和癌癥病死率第4位[1]。盡管肝癌的5年生存率已從40 年前的3%提升到目前的18%，但仍遠遠低于全球發病率高的其他實體腫瘤，例如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌的5年生存率分別為65%、90%、98%[2]。美國肝癌死亡人數2000 年到2016 年增加了43%，從每10萬人死亡7.2人上升到10.3人。根據世界衛生組織估計，2030 年將有100 多萬患者死于肝癌[3]。提升肝癌生存率仍然是當今緊迫的難題。多種誘導腫瘤細胞凋亡的藥物和療法被證明對腫瘤治療有效，誘導肝癌細胞凋亡希望成為更有前途的肝癌治療方案。肝癌的發生和發展表現肝癌細胞凋亡的失調與大量細胞信號通路異常傳導密切相關，如PI3K/AKT/mToR[4]、Wnt/β-catenin[5]、ras/raf/MRPK[6]、NF-κB[7]、Hedgehog[8]、Notch[9]等。Notch信號通路在組織發育和生理過程中高度保守，調控細胞凋亡。包括肝癌在內的各種肝臟疾病中，Notch信號通路均異常傳導[10]。Notch信號通路對肝癌細胞凋亡的作用因細胞和分子環境不同，表現出抑制或促進細胞凋亡的作用[11]。本文就Notch信號通路在肝癌細胞凋亡中的作用及其機制做一綜述。

1 Notch信號通路在細胞凋亡中的作用

Notch信號通路進化上高度保守，調節組織發育和內環境穩定[12]。Notch信號通路主要包括依賴和非依賴細胞核內轉錄因子CSL（C-promoter binding factor-1、CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）的兩種Notch信號通路活化方式。依賴CSL的經典Notch信號傳導通路開始于細胞膜的相互接觸，Notch信號通路發送細胞（表達果蠅體內的Delta和Serrate及線蟲體內的lag-2，DSL配體）膜和鄰近的接受細胞（表達Notch受體）膜接觸，啟動Notch信號通路，信號接受細胞的Notch受體經過金屬蛋白酶和γ-分泌酶介導的兩次連續切割，釋放Notch受體細胞內區（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細胞核內，與細胞核內轉錄因子CSL結合，從而激活Notch信號通路的靶基因HES和HEY家族，調節細胞凋亡相關基因表達，調控細胞凋亡。非依賴CSL的Notch信號通路NICD并不易位至細胞核內，而是在胞漿中與其他信號通路（如β-catenin、PI3K/AKT等）蛋白相互作用，調控目標蛋白的表達，影響細胞的凋亡。細胞凋亡主要包括外源性途徑和內源性途徑。外源性途徑又稱為死亡受體途徑，通過跨膜受體介導，活化天冬氨酸蛋白水解酶caspase家族，誘導細胞凋亡。內源性途徑又稱線粒體途徑，刺激直接產生細胞內信號，引起線粒體膜結構改變，釋放促凋亡物質，誘導細胞凋亡[13]。依賴CSL的經典Notch信號通過Hes1-PTEN-AKT-mToR途徑調控細胞凋亡[14]，而非依賴CSL的Notch信號通路則通過NICD-mToR2-AKT-mToR介導細胞凋亡[15]。介于細胞類型不同和相關信號通路之間串擾的影響，Notch信號通路在同一腫瘤不同的細胞亞型和不同的腫瘤細胞系中表現出抑制和促進凋亡的不同作用[10，16]。Yoon等[17]通過轉染的方法，使唾腺癌細胞過度表達Notch信號通路，結果細胞凋亡率明顯下降，上調Notch信號通路抑制唾腺癌細胞凋亡。Wang等[18]應用小分子干擾RNA和γ-分泌酶抑制劑處理胰腺癌細胞，下調Notch信號通路，結果細胞凋亡率明顯增加，從而間接證實了活化的Notch信號通路抑制細胞凋亡。此外，NICD移位進入細胞核內，激活Notch信號通路靶基因CDK2、VEGF和MMPS表達，抑制細胞凋亡[19-20]。Notch信號通路除表現抗凋亡作用，還表現促凋亡作用，例如在小鼠表皮和成年小鼠角膜上皮的研究中，Notch信號通路通過抑制β-catenin信號通路，促進細胞凋亡[21]。Notch信號通路對于同一細胞系的不同亞型亦表現出雙重的凋亡作用，Notch信號通路激活后保護1 型β細胞免于凋亡，當應用γ-secretase抑制劑（gamma secretase inhibitor，GSI）處理細胞，下調Notch信號通路后，1 型β細胞凋亡顯著增加，但對于2 型β細胞，采用GSI處理卻上調抗凋亡基因Bcl-2，抑制細胞凋亡[22]。Notch信號通路在細胞凋亡中表現的抑制和促進凋亡作用，主要依靠不同的組織類型和其與其他細胞信號通路間的“串話”。

2 Notch信號通路在肝癌細胞凋亡中的作用

肝癌的發生發展與Notch信號通路的異常傳導密切相關，因受肝細胞和肝臟成分細胞（如膽管細胞、內皮細胞、星狀細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等）相互作用影響，不同肝癌組織中Notch信號通路呈上調或者下調的不同表達結果。Yang等[23]報道肝癌組織中Notch-1、Notch-3和Notch-4受體表達水平明顯高于癌旁和正常肝臟組織，在肝癌和腫瘤周圍組織之間未發現Notch-2 表達差異，Notch-3 的表達增加與肝癌的血管浸潤性密切相關。Ahn等[24]研究取得了與Yang相同的Notch受體過表達結果，即肝癌組織中Notch-1、Notch-3和Notch-4高表達，同時報道了Notch-1高表達的患者預后具有高復發風險。Hu等[25]報道與正常肝組織相比，Notch-3在HCC組織中高表達，且Notch-3高表達的腫瘤體積更大、腫瘤更早復發、腫瘤分期更晚和總生存期更短的特點。此外，除肝癌組織外，研究顯示HepG2 肝癌細胞系Notch-3受體、Jagged1和Deltal配體高表達[26]。然而，也有研究報道肝癌組織中Notch信號通路受體蛋白相對于正常肝組織低表達的結果。Sui等[27]收集肝癌組織樣本30例，通過qRT-PCR分析，發現正常肝組織中Notch-1 mRNA的表達水平為（10.3±3.1），而肝癌組織中Notch-1 mRNA的表達水平為（5.1±2.1），肝癌細胞Notch-1 mRNA明顯低于肝正常細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05）。蛋白質免疫印跡分析，顯示與正常肝組織相比，Notch-1蛋白的表達在肝癌組織中顯著降低（P＜0.001），同時還發現與正常肝臟組織相比，肝癌細胞中NICD蛋白的表達顯著降低（P＜0.001）。Notch信號通路在肝癌組織胞中的“對向”差異性，促使其在肝癌細胞凋亡中呈現雙向作用。

2.1 下調Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡

Notch信號通路上調的肝癌細胞，Notch信號通路抑制細胞凋亡。下調Notch信號通路，解除Notch信號通路抑制肝癌細胞凋亡的關鍵因子，打開凋亡途徑，促進腫瘤細胞凋亡。

下調Notch信號通過PTEN/PI3K/AKT信號通路介導促進肝癌細胞凋亡。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN），是繼p53 后又一個與多腫瘤發生發展密切相關的抑癌基因，其編碼具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶雙重特異磷酸酶活性的蛋白，能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr都去磷酸化；PTEN通過去磷酸化參與細胞調控。磷酸化和去磷酸化是調節細胞活動的重要方式，許多癌基因的產物都是通過磷酸化而刺激細胞生長[28]。PTEN主要抑癌機制是PI3K/AKT通路的主要負調控因子。PTEN可以使磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）催化產物第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）第三位的磷酸基團去磷酸化，從而對能促進細胞增殖生長的PI3K/Akt信號轉導途徑起到負調控作用。Tian等[29]在肝癌細胞系Huh-7 中過表達MicroRNA-760，下調Notch信號通路，增加PTEN蛋白表達，降低PI3K/AKT活性，結果凋亡執行蛋白caspase-3蛋白表達水平增加，肝癌細胞凋亡增加。Yang等[30]應用小分子干擾RNA處理HepG2細胞，抑制Notch1受體蛋白的表達，發現Akt磷酸化的水平隨Notch1 受體蛋白表達的下降而降低，流式細胞結果顯示HepG2細胞凋亡明顯增加。下調Notch信號通路，解除HES對PTEN的抑制，上調PTEN蛋白的表達，從而抑制PI3K/AKT信號通路表達，誘導肝癌細胞凋亡。

Notch信號通路通過p53 介導調控肝癌細胞凋亡，p53是重要的腫瘤抑制基因，p53基因在正常情況下對細胞分裂起著減慢或監視的作用。p53 根據細胞DNA變異的程度而發揮不同作用，如果變異較小，p53 促使細胞自我修復，若DNA變異較大，p53誘導細胞凋亡。研究表明，Notch信號通路通過INK4a/ARF（inhibitor of CDK4/alternative of reading frame）的介導，干擾MDM2（murine double minute2）對p53的降解作用，下調Notch信號通路促進INK4a/ARF表達，減少MDM2對p53的降解作用，上調p53表達，誘導細胞凋亡[31]。Wang等[32]過表達RBP-Jinteracting and tubulin-associated（RITA），抑制Notch信號通路靶基因的轉錄，下調Notch信號通路靶基因HES1表達，結果發現RITA過表達增加p53的蛋白表達，誘導SMMC7721和HepG2細胞凋亡。Giovannini等[33]研究報道，沉默HepG2、SNU398和Hep3B細胞Notch3受體表達，導致p53上調，從而調控細胞周期蛋白G1表達以及miR-221和MDM2的前饋電路，促進肝癌細胞凋亡。

下調Notch信號通路通過內、外源途徑調控肝癌細胞的凋亡。內源途徑又稱線粒體途徑，主要是通過Bcl-2 和核蛋白改變線粒體膜結構。Bcl-2 家族主要包括：抗凋亡作用的Bcl-2，Bcl-xl，Mcl-L及Bcl-w等和促凋亡作用的Bax、Bak及Bok等[34]。Zhang等[35]研究報道，秋水仙堿（Silybin，SIL）下調肝癌細胞Notch信號通路NICD，RBP-Jκ和Hes1蛋白表達，下調凋亡通路相關蛋白Bcl-2 表達，并上調Bax表達，誘導細胞凋亡。Kunnimalaiyaan等[36]報道，在肝癌細胞株（HepG2、Hep3B和SK-Hep-1）中下調Notch信號通路表達，靶蛋白HES-1表達下降，細胞凋亡增加，其機制是下調Notch信號通路抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，誘導凋亡小體形成。Ke等[37]通過藥物TQ（thymoquinome）處理肝癌細胞，下調Notch信號通路，取得的結果與Kunnimalaiyaan等[36]報道的一致，下調Notch信號通路通過內源途徑調控肝癌細胞的凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，凋亡蛋白Bax表達增加，肝癌細胞凋亡增加。外源性途徑又稱死亡受體途徑，主要由膜上死亡受體介導，導致caspase-8活化，誘導腫瘤細胞凋亡。Huang等[38]研究發現，siRNA抑制Notch1的表達，有效的上調caspase-8表達，促進肝癌細胞H22的凋亡。

下調Notch信號通路配體Jagged1 表達，減少Notch信號通路激活，促進肝癌細胞凋亡。Ren等[39]報道，在肝癌細胞中過表達miR-199a-3p，有效地增加YAP1（yes associated protein 1）的表達，而YAP1直接抑制配體Jagged1表達，下調Notch信號通路激活，誘導肝癌凋亡。

下調動物體內細胞Notch信號通路，促進肝癌細胞凋亡。Zeyada等[40]應用氯硝柳胺聚合物膠束處理肝癌小鼠，蛋白免疫印跡結果顯示Notch1受體和靶基因HES1表達顯著下降，凋亡執行蛋白caspase-3的基因和蛋白表達水平增加，體內抑制Notch信號通路，促進肝癌細胞凋亡。Xiang等[41]在異種移植荷瘤肝癌裸鼠中，應用藥物下調Notch信號通路表達，有效抑制腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡。

Notch信號通路通過PTEN/PI3K/AKT信號通路、p53介導，或是調控Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達等機制，誘導肝癌細胞凋亡，但是具體完整機制尚需要進一步的研究。

2.2 上調Notch信號通路誘導肝癌細胞凋亡

Notch信號通路促進腫瘤細胞凋亡的作用取決于腫瘤細胞的背景，除下調Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡外，上調Notch信號通路亦可以促進肝癌細胞凋亡。Sui等[27]研究報道，Notch1質粒轉染HepG2和Hep3B細胞，上調Notch信號通路，帶有Notch1質粒的陽性細胞凋亡率明顯高于對照（P＜0.001），上調Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡，其作用機制是轉染Notch1 質粒顯著激活了2 種細胞系中JNK的磷酸化。JNK可以使位于c-Jun蛋白N端的氨基酸殘基63和73磷酸化，上調caspase-3和Bax表達，下調Bcl-2表達，促進肝癌細胞凋亡。此外，Wang等[42]報道了上調Notch信號通路，激活外源性細胞凋亡途徑，促進肝癌細胞凋亡的研究。研究人員將NICD轉染到肝癌SMMC7721 細胞中，結果轉染細胞24 h、48 h和72 h的細胞凋亡率呈現NICD劑量依賴性升高，其機制是上調的Notch信號通路，增加肝癌細胞p53表達，p53 的上調增加外源性細胞凋亡途徑TRAIL/DR5的表達，促進TRAIL誘導肝癌細胞凋亡。已有研究表明，TRAIL觸發的細胞凋亡是通過與死亡受體（DR4和DR5）結合并激活死亡受體來實現的，死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族；死亡受體位于細胞表面，通過與配體TRAIL結合而變得三聚化，然后通過胱天蛋白酶級聯反應快速激活來傳遞凋亡信號[43]。Qi等[44]激活Notch信號通路在體內體外均能誘導肝癌細胞凋亡，其機制是上調Notch信號通路增加p53的表達，高表達的p53可以通過上調Bax和下調Bcl-2表達水平促進肝癌細胞凋亡。

上調Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡，下調Notch信號通路亦可以誘導肝癌細胞凋亡。Notch信號通路對肝癌細胞的雙向作用，體現出Notch信號通路的傳導簡單性和作用復雜性的特點。進一步對Notch信號通路與其他細胞信號的“串話”研究，可能是解開Notch信號通路雙向調控肝癌細胞凋亡的關鍵所在。

3 小結與展望

肝癌細胞凋亡是一個復雜的生理過程，需要大量的信號通路共同作用。Notch信號通路與其他信號通路“串話”，表現出既抑制又促進肝癌細胞凋亡的雙向調控作用，這與肝癌細胞異質性密切相關，但詳細的分子機制尚需進一步研究。尋找Notch信號通路雙向調控肝癌細胞凋亡的關鍵點，打開Notch信號通路的細胞信號網絡，將為肝癌的靶向治療提供更廣闊的應用前景。