MicroRNA?21 調控破骨和成骨分化作用在正畸治療中的研究進展

陳澤策， 龍茜， 管曉燕， 劉建國，2

1.遵義醫科大學口腔醫學院，貴州 遵義（563099）； 2. 貴州省高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室 遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義（563006）

在正畸矯治的牙齒移動過程中，牙齒與頜骨以及其周圍組織受到機械力作用，由于張力側和壓力側受力不同，骨吸收和骨形成的活性空間分離，在骨表面舊骨吸收、新骨形成發生適應性骨塑建（bone modeling）［1］。骨塑建是由成骨細胞和破骨細胞功能平衡介導的；破骨細胞或成骨細胞分化的失調可導致骨平衡失調和骨質疏松癥。在正畸治療中，成骨細胞和破骨細胞的平衡介導著有效的牙齒移動，骨平衡失調會減緩牙齒移動速度?，F有研究證明microRNAs（miRNAs）具有調控成骨細胞和破骨細胞的分化和生物學功能的作用；而且在正常和炎癥微環境中均可調節正畸牙移動（orthodontic tooth movement，OTM）和牙槽骨重塑［2］。本文就miRNA?21 調控成骨細胞與破骨細胞分化作用在正畸治療中的應用研究進展作一綜述。

1 miRNAs 的結構及特性

miRNAs 作為一種小的非編碼RNA，主要存在于細胞核中；由RNA 聚合酶Ⅱ轉錄為長鏈的初級轉錄本，隨后被Drosha 裂解，產生長度約為70 個核苷酸的莖環結構前體分子（pre?miRNAs）。它最終被運送到細胞質中，并被RNase Ⅲ酶Dicer 進一步加工成成熟的miRNA。miRNAs 可以通過抑制信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻譯或通過結合其3′?未翻譯區（3’? untranslation region，3’UTR）來降解mRNA 分子，從而沉默同源靶基因；miR?NAs 之間靶向目標可能會重疊。miRNAs 可以通過DNA 或組蛋白修飾對表觀遺傳產生影響，并在轉錄水平上調節基因表達。研究表明，miRNAs 在破骨細胞、成骨細胞和其他類型細胞的增殖和分化中發揮重要作用［3］；此外，miRNAs 可能具有機械敏感性，并在骨塑建過程中成為關鍵的轉錄后調節因子［4］。

2 miRNA?21 的生物學特性

miRNA?21 是定位于染色體17q23.2 上的miR?NA，其與人類和大鼠空泡膜蛋白的同源物——編碼 液 泡 膜 蛋 白1（vacuole membrane protein 1，VMP1）的基因重疊。miRNA?21 被鑒定為一種致癌miRNA；其在大多數人類惡性腫瘤中過表達并作為腫瘤抑制因子；在腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲中發揮重要作用［5］。miRNA?21 調節多種腫瘤相關靶基因的表達，如蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）［5］、原肌球蛋白1（tropomyosin 1，TPM1）［6］、程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）［7］、叉 頭 框 蛋 白O1（forkhead box O1，FOXO1）［8］及Cdc25a［9］等。在免疫系統中，miRNA?21 能夠調節T 細胞免疫。研究發現，miRNA?21 在效應T 細胞中的表達頻率最高；表明miRNA?21 在維持T 細胞效應狀態中可能起著重要作用。同時，Chen 等［10］在斑馬魚胚胎的早期發育階段（12 h）可以檢測到miRNA?21 的表達，發現其在成纖維細胞中的表達約占40%。另外，有研究顯示miRNA?21在分支形態的發生過程中起著重要作用。Hayashi等［11］的研究發現，miRNA?21 的上調可以促進分支形態的發生；抑制miRNA?21 的表達則可以引起上皮芽數量的減少，但miRNA?21 在生長發育中的作用還有待進一步研究。

miRNA?21 除了在腫瘤、免疫和發育中發揮作用外，在促進破骨細胞生成和成骨分化中也起著不可或缺的作用。miRNA?21 可以調節成骨細胞和破骨細胞生成以防止骨吸收［12］。Sun 等［13］發現上調miRNA?21 可顯著增加了成骨相關基因標志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達水平；表明miRNA?21 促進了骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）在體外的成骨分化；micro?CT 顯示，miRNA?21 過表達可以增加新骨的形成和礦化，促進大鼠體內骨折愈合。miRNA?21 對機械刺激產生反應而調節成骨分化，在牙齒移動過程中可以調節OTM 和牙槽骨重塑［2］。相反，Wei 等［14］驗證了Smad5 是miRNA?21 的一個潛在下游靶點，抑制miRNA?21 可以通過靶向Smad5 減少人牙周膜干細胞（human periodon?tal ligament stem cells，hPDLSCs）的成骨分化。miR?NA?21 在成骨細胞和破骨細胞中具有雙重作用，其既可以促進成骨分化，也可以抑制成骨分化；但是miRNA?21 在骨形成和骨吸收中的具體作用機制尚未闡明。

3 miRNA?21 調控破骨分化對正畸治療的影響

在正畸牙移動過程中，壓力和缺氧均可能啟動破骨細胞生成；miRNA 在正畸牙移動中過程中對外界機械應力高度敏感，是維持骨骼內環境穩定的關鍵轉錄后調節因子［15］。miRNA?21 被認為是破骨細胞生成的調節劑和破骨細胞分化的啟動子。體外研究發現miRNA?21 通過調節PDCD4 或通過靶向Fas 配體（Fas ligand，FasL）促進破骨作用［16］。另外，miRNA?21 可以調節核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor?κB li?gand，RANKL）和骨骼保護因子（osteoprotegerin，OPG），它們在調節破骨細胞分化和骨吸收功能中起著關鍵作用［17］。有研究者將敲除OPG 小鼠與敲除RANKL 小鼠作對比，兩組小鼠均發生嚴重骨質疏松和骨壞死，證明了平衡的RANKL/OPG 比例是維持局部骨形成和骨吸收平衡的關鍵，對骨塑建至關重要［18］。RANKL 的產生與miRNA?21、白細胞介素?6（interleukin?6，IL?6）和靶向信號轉導子和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of tran?scription 3，STAT3）通路的調節反饋回路相關，而miRNA?21 的表達是由IL?6 誘導的，需要STAT3 通路的激活［19］。相反，miRNA?21 通過抑制PIAS3（protein inhibitor of activated STAT3）來增強STAT3依賴信號通路，而OPG 屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體配體超家族，是正常骨代謝中TNF 受體的關鍵成員，OPG 能拮抗RANKL 與核因子κB 受體活化因子（receptor activator of nucle?ar factor?κB，RANK）的結合，從而保持骨量的完整性。

在多發性骨髓瘤來源的BMMSCs 中，miRNA?21 通過靶向STAT3 通路激活因子直接靶向抑制OPG，間接促進RANKL 表達，提示miRNA?21 能促進破骨細胞發生［20］。敲除小鼠miRNA?21 基因后可觀察到破骨細胞的增殖受到抑制，干擾miRNA?21 后在促進骨形成的同時抑制了BMMSCs 的集落形成和增殖［21］。有學者認為，PDCD4 是miRNA?21支持破骨細胞功能的功能靶點，可通過靶向PDCD4 抑制破骨細胞功能來阻斷雌激素減少后誘導的骨質減少，證明miRNA?21 通過靶向PDCD4 直接控制破骨細胞功能，促進體內骨吸收［12］。Wang等［22］發 現miRNA?21 可 在 翻 譯 水 平 上 負 調 控PTEN，miRNA?21 在破骨細胞形成過程中表達上調，促進成骨細胞分化和骨吸收；另外，miRNA?21還可能通過靶向PTEN 激活PI3K/AKT 信號通路促進破骨細胞生成和骨吸收。C?Fos 上調了miRNA?21 的表達，而miRNA?21 通過下調PDCD4 蛋白的表達，減少了C?Fos 在RANKL 誘導的破骨細胞形成過程中的抑制作用。還有研究發現抑制miRNA?21的表達可能與腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis fac?tor?α，TNF?α）抑制雌激素缺乏性骨質疏松癥的骨形成有關。許諾等［23］通過細胞學實驗證明miRNA?21 可以促進破骨細胞的增殖，骨破壞標志因子端粒酶調節蛋白（target of RNAⅢactivating protein，TRAP）與組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）的表達在慢性牙周炎組織中明顯增高，并且miRNA?21 的表達與骨破壞標志因子間有明顯相關性，提出miRNA?21 可以作為治療牙周炎骨破壞的靶點。

研究表明OTM 也受免疫系統的控制，T 細胞通過Th1 相 關 細 胞 因 子 促 進OTM。Wu 等［24］發 現miRNA?21 結構缺失會減緩牙齒移動速度、抑制破骨細胞生成數量；通過向小鼠體內注入活化的T 細胞，觀察到小鼠的破骨細胞數量明顯升高，牙齒移動距離增加，意味著破骨細胞通過T 細胞增加了RANKL/OPG 的表達，從而促進了OTM。李夢瑩等［25］報道在無機械力刺激的情況下，miRNA?21?/?小鼠上頜腭中縫組織的破骨細胞生成和骨吸收受到抑制。Zhang 等［26］首次探討miRNA?21 在牙周加速成骨正畸（periodontal accelerate osteogenesis or?thodontics，PAOO）中成骨和破骨分化中的調控作用，發現miRNA?21 過表達后負調控靶基因PDCD4的表達，導致破骨細胞相關轉錄因子C?Fos 的表達水平升高，破骨細胞增加，牙槽骨發生塑建，正畸牙齒移動量增加。綜上，miRNA?21 可以調節破骨細胞的分化，影響骨組織的塑建，在施加正畸力后，miRNA?21 可促進破骨細胞生成從而加快正畸移動速度，但其具體的作用機制還有待進一步研究。

4 miRNA?21 調控成骨分化對正畸治療的影響

研究發現，miRNA?21 不僅影響骨吸收，還影響骨形成和骨分化；并且miRNA?21 的缺乏會影響骨重塑的發生，這與促進破骨細胞生成的研究結果相反［27］。miRNA?21 在成骨細胞?破骨細胞偶聯過程中的雙重作用，可能是與其靶點在成骨過程中的動態調節有關。Smieszek 等［28］建立了穩定的小鼠成骨前細胞（MC3T3）與破骨細胞前體細胞系（4B12）的間接共培養體系，探討抑制miRNA?21 對成骨和破骨相互作用的影響；發現在體外成骨的第7 天和第15 天，MC3T3 細胞中miRNA?21 表達上調，而OPN 水平下降；然而MC3T3 與4B12 細胞共培養時，OPN 水平升高，在MC3T3inh21/4B12 共培養中其表達水平顯著降低；表明成骨細胞產生的OPN 可以激活破骨細胞的骨吸收，在調節破骨細胞?成骨細胞偶聯中起著關鍵作用。Zhang 等［29］建立大鼠正畸牙移動模型，在缺氧環境中，缺氧誘導因子?1α（Hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）和miRNA?21 的表達顯著上調，miRNA?21 模擬物增加了HIF?1α 的表達，促進成骨分化，成骨標志物OPN、Runt 相關轉錄因子2（runt?related transcrip?tion factor 2，Runx2）、ALP 的表達均上調；表明miR?NA?21 對低氧下牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLCs）中HIF?1 的表達有促進作用，并且在正畸牙移動過程中促進成骨分化。

與靜態PDLSCs 相比，拉伸PDLSCs 過程中，miRNA?21 的表達水平明顯升高，證實了miRNA?21與機械力誘導的PDLSCs 成骨分化有關［30］。激活素受體2B（activin receptor type ⅡB，ACVR2B）是成骨分化的關鍵調控因子；ACVR2B 功能的獲得或者缺失均會對PDLSCs 成骨分化產生影響；miRNA?21通過靶向ACVR2B 調控PDLSCs 的牽張成骨分化。王紅等［31］通過敲除miRNA?21 基因的小鼠成功建立了上頜骨缺損模型，發現敲除miRNA?21 基因的小鼠的ALP 和OCN 的表達明顯減少，成骨能力減弱，表明miRNA?21 具有促進骨重塑的作用，并且敲除miRNA?21 基因抑制了骨缺損的愈合；注射miRNA?21 的過表達試劑可以提高敲除miRNA?21基因小鼠的骨愈合能力，加速新骨生成及礦化。Hong 等［32］研究發現miRNA?21 參與了正畸牙齒移動，是牙周膜組織重塑的重要調節因子。當施加牽引力時，上調的miRNA?21 促進了PDLSCs 的成骨分化，miRNA?21 在壓力側和張力側均過表達；miR?NA?21 在礦化早期高表達，在成骨晚期表達降低；提示miRNA?21 可能通過靶向調節牙周膜相關蛋白1（periodontal ligament associated protein?1，PLAP?1）在牙齒移動后期調控牙周膜重塑，改善牙齒移動的潛能。

正畸牙移動的早期階段，是一種炎癥階段，壓力和缺氧通過誘導無菌性炎癥反應，協同促進骨組織和牙周組織的重塑。TNF?α 是一種由巨噬細胞釋放的炎性細胞因子，可誘導骨吸收，被認為是參與牙周病發病的主要細胞因子，TNF?α 可以抑制PDLSCs 的成脂和成骨分化。在炎癥微環境中，TNF?α 抑制了miRNA?21 的表達。上調miRNA?21可通過抑制靶基因Spry1 部分減少TNF?α 損傷的成脂和成骨作用，提示miRNA?21/Spry1 功能軸在炎癥微環境下對PDLSC 分化中起關鍵作用，有修復牙周炎損傷的牙周組織的潛力［33］。Chen 等［2］報道，通過注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠牙周炎癥，miRNA?21 在炎癥中上調，牙齒移動速度與miRNA?21 低表達小鼠相比顯著增加；同時下調miRNA?21 也導致上頜骨骨量的減少，因此認為miRNA?21 在牙周炎癥微環境下同時介導OTM和牙槽骨重塑。miRNA?21 的缺乏導致壓力側與張力側牙槽骨破骨細胞生成被抑制；牙齒移動的模型中可以觀察到，miRNA?21 基因敲除后小鼠牙齒移動距離顯著小于野生型小鼠。

5 小 結

miRNA?21 可以在正畸治療中調節成骨細胞和破骨細胞生成以防止骨吸收，并且在破骨細胞和成骨細胞中的雙重作用，使骨重塑過程加快，但其具體作用機制尚未完全闡明，有待進一步的研究探討，以期成為正畸矯治中促進和控制正畸牙移動速度的新靶點。

【Author contributions】Chen ZC wrote the article. Long Q collected the references. Guan XY and Liu JG reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.