程序性死亡通路在膽紅素腦病機制中的研究

陽華妹

（桂林醫學院第二附屬醫院新生兒科，廣西 桂林 541199）

細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是機體為維護內環境穩定，由多種基因調控的細胞自主有序的死亡，目前共發現有5種死亡類型，具體信號轉導機制未完全闡明。目前對非結合白蛋白的膽紅素（unconjugated bilirubin with albumin，UCBA）介導腦損傷的研究涉及細胞凋亡、細胞焦亡、細胞自噬。膽紅素腦損傷的分子機制，新生兒血液中高濃度的UCBA可進入血腦屏障，主要作用于中樞神經核團的神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞等[1，2]，通過細胞膜和內質網、線粒體膜，介導中樞神經細胞的氧化應激反應、興奮性氨基酸、線粒體的能量衰竭、鈣信號傳導異常、細胞周期改變、半胱天冬酶激活等下游事件，引起中樞神經細胞程序性死亡和炎癥反應導致腦損傷[3，4]。本文重點就其中信號通路的標志物的研究進行綜述，為深入研究膽紅素腦病的發病機制提供新的視角，利于進一步研究膽紅素腦病的干預靶標。

1 細胞凋亡

1.1 細胞凋亡的特點 1972年Kerr發現鈣信號異常誘發大鼠前列腺退化中的凋亡細胞缺失而提出，細胞凋亡參與多系統疾病的發病機制，形態表現為死亡的細胞膜損壞，萎縮，胞質濃縮，核染色質固縮，DNA降解，有凋亡小體，特點是無炎癥反應[5]。凋亡依賴Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白系統與促凋亡系統的調控，活化的半胱天冬酶Caspase-3、Caspase-12為最終效應蛋白，共有3種信號通路途徑，目前研究最成熟，但具體的信號轉導機制仍未完全闡明。

1.2 細胞凋亡的信號通路

1.2.1 線粒體途徑（Ca2+-Caspase-9-Caspase-3通路）直接的觸發機制[4，6]：線粒體通透性轉變孔（mitochondrion Adrian permeability transit ion pore，MPTP）過度開放[4]，線粒體膜上的Bcl-2家族中的Bad（非磷酸化的）聯結Bax的同型二聚體，使Bax發生構象變化，形成單聚化并轉移至線粒體外膜，引起MPTP的開啟。信號通路：①Ca2+內流和細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）釋放，MPTP反應開放使線粒體的Ca2+內流，Cyt C從線粒體釋放入細胞質和活化，導致跨膜電位降低、ATP合成減少及下游的半胱天冬酶前體（procaspase）活化。②凋亡小體形成：Cyt C釋放后與Apaf-1形成Apaf-1/Cyt C復合體，復合體使Apaf-1發生構象變化，促進復合體與ATP/dATP的結合，激發其多聚化，從而形成凋亡體（apoptosis body）。細胞凋亡的啟動：凋亡體募集胞漿中的procaspase-9，通過自剪切激活后啟動Caspase的級聯反應，繼續活化下游Caspase-3、7等，并形成正反饋。細胞凋亡的執行：活化的Caspase-3能對其底物進行特異性切割，使DNA形成碎片，致使細胞凋亡。調控：Bcl-2家族：抗細胞凋亡的蛋白：Bcl-2、Bcl-x（L）等，如活性下調則促進細胞凋亡。Bcl-2同源結構域（BH1，BH2，BH3，BH4）：該酶無活性，但可增加線粒體膜的通透性。促細胞凋亡的蛋白：Bax，Bak，以及Bid，Bim，Bad等（只含有BH3結構域）等。國內外己有大量膽紅素腦病的哺乳動物模型中檢測到線粒體途徑的信號分子，證實了非白蛋白結合的膽紅素誘導Bax表達[6，7]，控制線粒體膜的通透性和跨膜電位，破壞細胞內鈣穩態致Ca2+信號異常[3，8]，促使Cyt C釋放、活化的Caspase-9、Caspase-3表達及細胞形態改變，導致細胞凋亡[9]。并且凋亡抑制劑能減輕膽紅素誘導的神經毒性[7]。

1.2.2 死亡受體活化途徑（Ca2+信號—Caspase-8-Caspase-3活化途徑）細胞內Ca2+濃度升高，激活并連接鈣調磷酸酶，使腫瘤壞死因子超家族轉錄因子去磷酸化，啟動受體活化途徑[10]。目前發現的死亡受體途徑主要有3種，其中UCBA介導的中樞神經細胞凋亡的死亡受體活化途徑目前僅有2種報道。其共同特點為死亡受體與特定的配體相結合，發生三聚化和構象變化，通過死亡結構域（death domain，DD）與其它連接蛋白組成復合物，死亡結構域相關的Fas蛋白（fas protein associated with the death domain，FADD）和TNFR蛋白TNFR-associated protein with death domain，TRADD），或死亡效應區（death effector domain，DED）等結合組成復合物，激活procaspase-8，之后分別通過兩種途徑最終激活procaspase-3，活化的Caspase-3引起細胞凋亡。①Fas/Fasl途徑：自殺相關因子（factor associated suicide，Fas）與其配體（factor associated suicide brigands，Fasl）是經典的途徑[10]，細胞表面的Fas受體與Fasl的三聚體結合，募集DD、FADD的DED，集合procaspase-8的DED，形成死亡誘導信號復合體（death-induced signaling complex，DISC），從而激活procaspase.8，使其水解、切割成活化的caspase-8，再激活下游不同的Caspase級聯反應，激活caspase-3，經外源性途徑誘導凋亡；或Caspase-8切割位于胞漿的Bid，截斷成Bid（bid），bid通過3-OH端與線粒體連接，誘導Cyt C釋放，激活前述內源性（線粒體）途徑誘導細胞凋亡。研究發現，暴露于高濃度UCBA的鼠腦組織或神經元中的細胞凋亡信號分子Fas/Fasl和Caspase-3、Caspase-8的過度表達，以及Bid被切成截短的Bid（bid）[9，11]，表明UCBA介導了中樞神經細胞凋亡的Fas/Fasl途徑，引起細胞凋亡。但對于UCBA介導這一信號通路途徑中的完整的基因檢測的研究罕見報道。②TNFR途徑：TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）與TNF結合成三聚體，集合TRADD、FADD、TRAF-2和RIP1，FADD依次激活caspases.8、caspase.3促凋亡[12]。復合物I形成及泛素化使NF-KB，抑制凋亡，TNF聯結DD與TNFR1后發生三聚化，集合TRADD和其它蛋白，如TNF-α 相關因子2（TNF receptor associated factors，TRAF2）、細胞凋亡抑制蛋白（cell ular inhitor of apoptosis protein，cIAP）cIAP1、cIAP2、受體相互作用蛋白1（receptor interacting proteins，RIP1），形成復合物I結合到質膜上。復合物I激活NF-κB和AP-1。非降解性多聚泛素鏈修飾RIP1等銜接蛋白，形成泛素化狀態。泛素化激活IkB激酶（kappaKinsey，IKK），將NF-κB抑制蛋白IkBa磷酸化后，IkBα 被泛素蛋白酶復合體降解，使NF-kB激活后移位到細胞核并轉錄，誘導細胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apotheosis protein，IAP）如 cIAP -l、cIAP -2、cFLIP、TRAFl、TRAF2等的轉錄[6]。去泛素化和DISC形成，激活Procaspase-8，發生細胞凋亡，去泛素化酶降解多聚泛素鏈修飾RIP1的反應，使其去泛素化，聚合RIP3以及TRADD、FADD、Procaspase-8組成復合物11（即DISC），Procaspase-8活化，使RIP1、RIP3剪切失活，進而激發前述2種內源性和外源性途徑[4]，最終形成caspase-3，誘導細胞凋亡[12]。DISC形成后，如NF-kB如被激活，cFLIP轉位到DISC，阻止Procaspase-8的激活，從而抑制細胞凋亡，反之促凋亡。抑制Caspase可阻止RIP1泛素化，刺激DISC復合物的形成[12，13]，促進細胞凋亡。國外研究發現[9，14]，大鼠星形膠質細胞體外暴露于UCBA中會增加TNFR途徑中的TNFR1和NF-KB、IL-1β、Caspase-8、Caspase-3的表達；而使用FNFR1基因沉默技術可在短時間內降低膽紅素誘導的細胞死亡。這些實驗結論支持了TNFR信號通路在膽紅素腦損傷機制中的重要作用[9，13]，但具體的信號轉導機制未進行深入研究。

1.2.3 內質網應激（ER stress，ERS）ERS是近年發現的細胞凋亡信號通路。ER是細胞內蛋白質的合成及折疊、聚集的場所。內環境紊亂或損傷因素可引起非折疊的蛋白或錯誤折疊的蛋白在細胞內過多地聚集，啟動一系列基因表達，引起ERS，以促進損傷的修復，嚴重ERS則促進損傷效應，引起細胞凋亡。目前對其信號通路的研究主要是非折疊蛋白的反應（unfolded protein reaction，UPR），并與線粒體途徑和死亡受體活化途徑相互作用[18]。UPR-Caspase-12活化途徑[14，15]3個代表非折疊蛋白的反應的標志性分子（內質網跨膜蛋白IRE1、aATF6、PERK）與免疫球蛋白結合蛋白葡萄糖調節蛋白78（glucose regulating protein78，GRP78）/Bi的解離，促進中間信號分子c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinsey，JNK）、CHOP、Bcl-2家族的活化，最終啟動Caspase-12活化，具體信號通路如下：CHOP：從GRP78/Bi解離的R樣內質網激酶蛋白激酶（protein Kinsey R-like ER Kinsey，PERK）被磷酸化，并依次激活真核起始因子2（eurydice imitation factor-2，eIF2）、eIF2、ATF4；肌醇需求酶1-a（luminosity-requiring enzyme 1，IRE1-a）；依次激活TRAF2、ASK1、P38蛋白激酶（P38MAP）；激活轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6），經高爾基體作用生成P50 ATF6。此3條途徑均能激活CHOP，激活的CHOP過多聚集在細胞核內，直接促進細胞凋亡，下游信號轉導機制不明。另外CHOP、JNK還可通過上調Bcl-2家族BH3-only蛋白，以及促進內質網上的Ca2+向細胞質釋放，進入線粒體/死亡受體凋亡信號途徑。JNK：JNK通過2種方式依次激活IRE1-a、TRAF2、ASK1，或通過激活Fas從而激活JNK，促進細胞凋亡：JNK通過磷酸化Bcl-2、Bcl-xL，抑制其抗凋亡作用；或使Bid、Bim磷酸化，加強其促凋亡作用。Caspase-12 ERS時，IREla激活募集的TRAF2，切割活化的Caspase-12，并依次使procaspase-9、procaspase 3被活化，使DNA被剪切，發生細胞凋亡。UCBA與中樞神經內質網應激研究，近年來，國內外較多哺乳動物研究發現，UCBA誘導中樞神經的信號 分 子CHOP RNA、GRP78、PERK、IRE1-a、eIF2、ATF6、IRE1-a、c-Jun、Caspase.12、JNK等的過表達，其基因變化符合內質網應激和未折疊的蛋白反應的全組基因組地表達[16]，證實在膽紅素腦損傷的機制中內質網應激有重要作用，內質網應激的抑制劑可能是降低膽紅素UCBA誘導的神經毒性的潛在治療方法[17]。

2 細胞自噬

特點是細胞內物質被自噬泡（雙層膜結構）包裹，并與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，之后細胞內物質被降解利用。內環境紊亂等因素促進自噬地激活，抑制細胞凋亡，如失控則引起自噬性死亡。

2.1 信號通路啟動 MTOR-BULK-III級P13K等復合體通路，饑餓、缺氧、ERS、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapacity，MTOR）抑制劑下，AMPK活化，MTOR失活[2，18]?；罨腁MPK催化復合體ULK（成分：mAtg13、FIP200、ULK1、ULK2）的多位絲氨酸（317、467、555、574、637、777）發生磷酸化[19]，促進自噬。如AMPK失活，第757位絲氨酸與MTOR結合使其活化，則抑制自噬。

2.2 復合物和自噬體 Beclin-1（酵母Atg6同源物）結合P150（酵母Vps15同源物）和hVps34、Bark或抗紫外線照射的基因（UVRAG）共同組成III級P13K復合體[19]，是與自體吞噬相關的基因。自噬體的生成需Atg12-Atg5結合微管相關蛋白II輕鏈3（microtubule -associated protein light chain 3 -II，LC3-II）形成復合物：Atg12-Atg5形成需Atg7和Atgl0泛素樣反應，繼而Atgl2-Atgl25連接。LC3的C端被Atg4蛋白所酶切之后生成LC3-I（需磷脂酰乙醇胺和LC3-I連接Atg3和Atg7），自噬體膜吸附連接后的LC3-I和LC3-II。然后，Atg12-Atg125與Atg6組成更大的復合物。

2.3 上游UPR調控通路 研究發現[2，18]，細胞自噬是ERS的下游通路。ERS通過PERK、IRE1、ATF6途徑誘導自噬，PERK激活磷酸化的eIF2，活化Atg12觸發自噬；IRE1通過與胞漿銜接TRAF2激活JNK，上調Atg5、Atg7，均導致LC3-I向LC3-II轉化增加，LC3-II增多促進自噬。胞腔內Ca2+通過活化依賴鈣調蛋白的蛋白激酶（the protein kinase that dependent calmodulin），激活AMPK，使MTOR的活性降低，誘導細胞自噬[19]或Ca2+通過抑制自噬體的降解促進細胞自噬[2]。內質網局部產生的R0S可激活JNK，也促進細胞自噬。但細胞缺氧時，ATF4直接與AMP反應元件結合蛋白（cyclic-AMP response element binding protein，CREB）結合，使LC3-I向LC3-II轉化，促進ERS以及依托ATF4的細胞自噬。國外部分研究發現[2，18]，鼠的膽紅素腦病模型中LC3-I向LC3-II轉化，UCBA誘導人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y自噬的模式為鈣/PKC信號傳導、內質網應激、MTOR失活。以上研究證實了細胞自噬在膽紅素腦病中的作用。自噬是未連接白蛋白的膽紅素誘導ERS的下游通路及晚期事件，有研究發現人和鼠模型中自噬促生存，也有少數研究發現膽紅素早期誘導細胞自噬促進存活，后期促進死亡。

3 細胞焦亡

3.1 細胞焦亡的特點 細胞焦亡是近年新發現的一種高度炎癥性的細胞程序性死亡；在形態上與凋亡相似，但同時伴隨炎性介質釋放，這一特性又與壞死相似[22]。

3.2 信號通路 主要包括經典途徑和非經典途徑。經典途徑：Caspase.1作為關鍵酶被激活后促進底物的剪切和多聚化，底物包括多種Mastermind（GSDM）家族成員。其中GSDMD被Caspase-1剪切后，通過N端成孔結構域（PFD）多聚化，導致細胞膜出現孔隙[23]，引起細胞焦亡；此外，Caspase 1還能切割炎癥因子的前體，使pro-IL 1β 和pro-IL 18活化成IL 1β 和IL 18，引起炎癥反應，同時通過多種炎性通路誘導細胞死亡，加重細胞焦亡的損傷級聯[22，24]。非經典的信號通路由激活Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11來實現。抑制細胞孔隙的形成是阻斷細胞焦亡的關鍵[23]。

3.3 UCBA介導的中樞神經細胞焦亡地研究 重慶大學華子瑜團隊的研究證實了未連接白蛋白的膽紅素誘導鼠大腦皮質星型膠質細胞和海馬組織中細胞焦亡關鍵酶Caspase-1的活化，以及腦組織中細胞焦亡相關炎癥因子IL 1β、IL 18和炎性小體NLRP3的表達增高，DNA斷裂細胞增多，并發現Caspase-1抑制劑阻斷細胞焦亡的作用[24]，初步證實細胞焦亡參與了膽紅素介導的腦損傷的發病機制，目前尚未發現進一步深入的研究。

4 總結

UCBA誘導神經細胞程序性死亡的信號通路中，各信號通路在內質網、線粒體和/細胞膜水平通過鈣信號、Bcl-2/Bax系統、JNK和炎癥因子關聯和調控，而Caspase-3是多種級聯反應的關鍵的蛋白酶和最終效應蛋白，機制復雜，且3種程序性細胞死亡均為一般情況下的促生存，和失控情況下的促死亡，故研究某種干預作用時需觀察對各種細胞程序性死亡方式的影響。并需動態觀察細胞形態、基因表達、血清標志物，結合臨床表現多種方式來研究，切忌片面化，未來需進一步深入探討。