工程酵母助力真菌嵌合萜類合酶的快速系統(tǒng)挖掘

范震，潘海學(xué)，唐功利

（1 中國科學(xué)院大學(xué)杭州高等研究院，化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310024；2 中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

萜類是自然界中數(shù)量最龐大的一類天然產(chǎn)物，至今已有超過10 萬種［1-2］。萜類存在于所有生命領(lǐng)域中，在植物、真菌和海洋無脊椎動(dòng)物中最為普遍，萜類化合物在防御、調(diào)節(jié)和信息交流等方面發(fā)揮著重要作用，并被廣泛用作藥物、香料和調(diào)味品等［3-4］。盡管萜類數(shù)量龐大且結(jié)構(gòu)多樣，但所有的萜類天然產(chǎn)物骨架都由五碳結(jié)構(gòu)單元二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）和異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，ⅠPP）縮合形成，因此萜類也被稱為類異戊二烯類化合物［2］。五碳結(jié)構(gòu)單元DMAPP和ⅠPP在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（PT）的催化下，以常規(guī)的頭尾連接的方式縮合成不同長(zhǎng)度聚異戊二烯基焦磷酸，如FPP（farnesyl diphosphate）、GPP（geranyl diphosphate）、GGPP（geranylgeranyl diphosphate）、GFPP（geranylfranesyl diphosphate）（圖 1）［2］。除此之外，PT 還可以催化非常規(guī)類型的類異戊二烯焦磷酸的縮合，如以非頭尾連接方式的碳鏈縮合［5］，順式（Z型）雙鍵的碳鏈縮合［6］等，因評(píng)論的工作中不涉及該類PT，本文對(duì)此不做過多的評(píng)述。萜類合酶（TS）利用PT 合成的鏈狀前體合成萜類的基本骨架，在萜類化合物的形成和萜類結(jié)構(gòu)的多樣性中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［2］。PT 和TS 負(fù)責(zé)形成的萜類基本骨架，再經(jīng)過各種修飾，如氧化、官能團(tuán)引入等，最終生成更加多樣的萜類產(chǎn)物。

圖1 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（PT）和萜類合酶（TS）催化萜類基本骨架形成的簡(jiǎn)略過程Fig.1 Formation of terpenoid skeletons through the catalysis by isopentenyl transferase(PT)and terpene synthase(TS)

TS 催化萜類基本骨架形成過程中，首先形成高活性的碳正離子中間體，從而引發(fā)環(huán)化串聯(lián)反應(yīng)，該環(huán)化串聯(lián)反應(yīng)也是自然界中最復(fù)雜的反應(yīng)之一［2］。根據(jù)TS起始引發(fā)碳正離子形成策略的不同，將TS 分為Ⅰ型和Ⅱ型［2］。Ⅰ型萜類合酶含有富含天冬氨酸（Asp）和與金屬陽離子配位的兩個(gè)保守基序DDXXD/E和（N，D）XX（S，T）XXXE，金屬離子通過結(jié)合聚異戊二烯基焦磷酸鏈狀前體的焦磷酸基團(tuán)來固定底物，同時(shí)促進(jìn)前體烯丙基焦磷酸基的C—O 鍵的電離，從而產(chǎn)生高活性的碳正離子中間體，進(jìn)而引發(fā)環(huán)化串聯(lián)反應(yīng)［圖2（a）］。而Ⅱ型萜類合酶通常僅含有呈酸性的DXDD 保守基序，通過其中的Asp 殘基將異戊二烯基中的雙鍵質(zhì)子化，生成引發(fā)環(huán)化反應(yīng)的碳正離子中間體［圖2（b）］［7-9］。

圖2 Ⅰ型和Ⅱ型萜類合酶（TS）催化環(huán)化的過程的兩例Fig.2 Two cases for cyclization catalyzed by TypeⅠand TypeⅡterpene synthases(TSs)

通常情況下TS和PT單獨(dú)行使其功能，但在一些酶中兩個(gè)（TS 和PT/TS）活性結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在，構(gòu)成可連續(xù)反應(yīng)的兩個(gè)獨(dú)特活性位點(diǎn)，因此賦予這些酶雙功能性［10］。目前發(fā)現(xiàn)的雙功能萜類合酶有：Ⅰ型TS+Ⅱ型TS 酶，Ⅱ型TS+PT 酶，Geosmin合成酶，以及Ⅰ型 TS+PT 酶（圖 3）［10］。在理論上，這些雙功能酶兩個(gè)活性位點(diǎn)空間上是相互接近的，因此具有增加產(chǎn)物量的優(yōu)勢(shì)［10-12］。

圖3 4種嵌合萜類合酶催化反應(yīng)范例Fig.3 Catalytic reactions of 4 chimeric terpene synthases

真菌特有的嵌合萜類合酶（PTTS）指的是Ⅰ型TS+PT 酶，包括一個(gè)C 端PT 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)N 端Ⅰ型TS 結(jié)構(gòu)域。這些PTTS 可以直接利用ⅠPP和DMAPP 作為共底物形成二萜和二倍半萜骨架［10，13］。自嵌合二萜合酶 PaFS 和嵌合二倍半萜合酶 AcOS 發(fā)現(xiàn) 以來［14-15］， 僅有 約 20 個(gè) PTTS 被報(bào)道，并且PTTS 催化生成的化合物大多具有新穎的碳骨架。根據(jù)其催化環(huán)化的機(jī)制，可將PTTS 分為A 型和 B 型，A 型是在 GFPP 的 C1-C11/C10-C14 之間環(huán)化（C1-Ⅳ-Ⅴ），形成5～15環(huán)系統(tǒng)，B型是在GFPP 或 GGPP 的 C1-C15/C14-C18 處環(huán)化 （C1-Ⅲ-Ⅳ），而生成5～11環(huán)系統(tǒng)（圖4）［13］。

圖4 PTTS催化的兩種環(huán)化類型Fig.4 Two cyclization reactions catalyzed by PTTS

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，需要功能鑒定的PTTS 數(shù)量不斷增加，對(duì)PTTS 研究產(chǎn)生了一些有待回答的問題，如PTTS 在真菌中是廣泛分布的還是局限于某些特定的群體，以及哪些機(jī)制控制著PTTS 的功能進(jìn)化等，回答這些問題需要對(duì)大量的 PTTS 進(jìn) 行 功 能 表 征［16］。 雖 然 米 曲 霉（Aspergillus oryzae）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于真菌基因的異源表達(dá)，且該體系表征過多種絲狀真菌來源的PTTS［17-18］，然而受限于米曲霉復(fù)雜的遺傳操作、較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，這個(gè)系統(tǒng)不適合大量未知PTTS功能的快速驗(yàn)證。高效萜類前體供給的大腸桿菌和釀酒酵母底盤，為法尼烯、紫杉二烯和青蒿酸［19-21］等的大量生產(chǎn)提供了有效的途徑。此外，以代謝工程改造的酵母來進(jìn)行藥物核心結(jié)構(gòu)骨架的生產(chǎn)，隨后經(jīng)過簡(jiǎn)單的化學(xué)后修飾可合成最終藥品，極大簡(jiǎn)化了藥物化學(xué)合成的過程（圖5）［22-23］。最近武漢大學(xué)劉天罡教授課題組與美國田納西大學(xué)陳峰教授課題組合作，使用高產(chǎn)萜類前體的酵母系統(tǒng)和高通量自動(dòng)化平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)PTTS 功能的快速驗(yàn)證［16］。

圖5 代謝工程結(jié)合化學(xué)合成的方法合成青蒿素和(-)-englerin AFig.5 Synthesis of artemisinin and(-)-englerin A by metabolic engineering combined with synthetic chemistry

首先，合作團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)分析了NCBⅠ和UniProt數(shù)據(jù)庫中所有真菌來源的基因以及JGⅠ數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)測(cè)序的477 種真菌的基因組，共找到了227 個(gè)PTTS 同源基因，其中包括已經(jīng)鑒定功能的20 個(gè)PTTS基因。對(duì)這227個(gè)PTTS同源基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PTTS 基因只存在于雙核菌亞界（Dikarya），其中224 個(gè)分布在子囊菌（Ascomycota）中， 另外 3 個(gè) PTTS 基因存在于擔(dān)子菌（Basidiomycota）的一個(gè)種中。由此作者推測(cè)，PTTS 基因起源于雙核菌亞界，擔(dān)子菌中PTTS 基因的缺失，很可能是在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了頻繁的基因丟失導(dǎo)致的；另一種可能性是PTTS 基因起源于子囊菌，擔(dān)子菌中某些菌含有的PTTS 基因是通過基因的水平轉(zhuǎn)移獲得的。為了進(jìn)一步了解這些基因進(jìn)化的關(guān)聯(lián)性，研究者對(duì)227 個(gè)PTTS 基因進(jìn)行了系統(tǒng)的進(jìn)化分析。前期研究報(bào)道，PTTS 可分為 6 個(gè)分支（A～F）［10］，處于 A、E 和 F 亞家族中的基因形成CladeⅠ，催化GFPP的A型（C1-Ⅳ-Ⅴ）環(huán)化，其余亞家族的基因形成Clade Ⅱ，催化GGPP 或 GFPP 的 B 型（C1-Ⅲ-Ⅳ）環(huán)化［10］。考慮到之前研究PTTS 數(shù)量較少，信息不夠全面，作者對(duì)得到的PTTS 做了更全面的進(jìn)化分析，結(jié)果顯示支持前期研究結(jié)果。并且進(jìn)化分析的結(jié)果顯示，在A～F 這6 個(gè)PTTS 亞家族中，每個(gè)亞家族都有90%以上的PTTS 基因功能是未知的，表明對(duì)PTTS生化功能認(rèn)識(shí)上還存在很大的不足［16］。

為了獲得更多的PTTS 催化功能信息，合作團(tuán)隊(duì)對(duì)上述PTTS 進(jìn)行了功能鑒定。首先依據(jù)氨基酸（aa）序列長(zhǎng)度（約700 aa）、序列相似性（＜80%）、TS 結(jié)構(gòu)域 DDXXD/E 和 NSE/DTE 以及 PT 結(jié)構(gòu)域DDXXD/N 的保守序列這些特征，對(duì)PTTS 進(jìn)行了篩選，從中選出了74 個(gè)PTTS。因已報(bào)道的20 個(gè)PTTS 主要催化二倍半萜的產(chǎn)生，因此研究者在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的高產(chǎn)萜類化合物的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYZL141 的基礎(chǔ)上［11］，又過量表達(dá)了GFPP 合成酶和PTTS，構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)二倍半萜的酵母底盤。該底盤一方面增加了GFPP 的代謝通量，使得嵌合的二倍半萜合酶的功能可得到快速鑒定，另一方面有助于釋放嵌合的二萜合酶利用GFPP 的潛力，使得嵌合的二萜合酶在合成二萜的同時(shí)還可合成二倍半萜。此外，他們利用高通量自動(dòng)化平臺(tái)批量構(gòu)建了74個(gè)PTTS的酵母工程菌株，該平臺(tái)的應(yīng)用大大加快了PTTS 功能鑒定的進(jìn)程。利用上述代謝工程策略，合作團(tuán)隊(duì)成功鑒定34個(gè)新的有功能的PTTS（圖6），鑒定的PTTS 的數(shù)量超過了目前已知功能PTTS 的總數(shù)。從34 個(gè)PTTS 的酵母工程菌株中共鑒定了24 個(gè)二萜和二倍半萜產(chǎn)物（圖6），其中2個(gè)是結(jié)構(gòu)新穎的二倍半萜 sesterevisene 和 sesterorbiculene。24 個(gè)產(chǎn)物中有11個(gè)是已報(bào)道的PTTS的產(chǎn)物（圖6），這表明這類酶在功能上進(jìn)化的一致性。有5個(gè)產(chǎn)物是已報(bào)道的植物來源二倍半萜合酶的產(chǎn)物（圖6），有1 個(gè)產(chǎn)物是鏈霉菌（Streptomyces violens）來源的二萜合酶產(chǎn)物（圖6），顯示了真菌、植物和細(xì)菌的基因功能趨同進(jìn)化的特征。54 種活性PTTS 共產(chǎn)37 種不同的萜類產(chǎn)物（圖6），以及新化合物的發(fā)現(xiàn)和鏈狀產(chǎn)物的產(chǎn)生（圖6）都表明PTTS 在進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)序列的變化導(dǎo)致其功能多樣性。

圖6 54個(gè)PTTS催化合成的萜類化合物及其結(jié)構(gòu)Fig.6 Terpenoids and their structures synthesized under the catalysis of 54 PTTSs

采用酵母底盤細(xì)胞對(duì)PTTS 的起源和功能進(jìn)化進(jìn)行的系統(tǒng)研究，為讀者清晰地呈現(xiàn)了真菌特有的這類PTTS 在真菌中存在和進(jìn)化的基本樣貌，描述了這類酶催化功能的多樣性，并且大大擴(kuò)充了這類酶家族成員的數(shù)量以及萜類產(chǎn)物庫，為后續(xù)的萜類合成生物學(xué)研究提供了豐富的基因元件，也為相關(guān)基因簇的挖掘奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。另外，該研究不僅為以酵母為底盤進(jìn)行萜類化合物的挖掘提供了一個(gè)可借鑒有效的方法策略，而且也是將天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)從原始的自然界生物材料中鑒定，轉(zhuǎn)變?yōu)閺木W(wǎng)絡(luò)基因信息挖掘到人為設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的一個(gè)成功范例。