PTEN、MMP-2、AKT在乳腺癌組織中的表達及相關性分析

周虹 錢金鋒 楊其昌 張曉娟 桑秋霞

乳腺癌是發生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，手術聯合放化療是其主要方法，早期診斷是保證治療效果的關鍵。腫瘤的發生發展與致癌基因、抑癌基因相關，PTEN-P13K/AKT通路的異常活化可能參與了乳腺腫瘤細胞增殖分化過程[1]。PTEN是惟一具有磷酸酶活性的一種抑癌基因，基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)為一種細胞外基質蛋白降解酶，蛋白激酶B(AKT)是原癌基因C-AKT蛋白表達產物，為調節細胞增殖轉錄的重要信號通路[2,3]。本文采用免疫組化的方法，分析PTEN、MMP-2、AKT在乳腺癌組織的表達，分析PTEN與MMP-2、AKT的相關性，旨在為乳腺癌早期診斷及預后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014至2015年乳腺癌手術患者76例，年齡29～77歲，中位年齡50歲；病理類型：浸潤性導管癌65例，其他11例。Elston和Ellis組織學分級[4]：Ⅰ級12例，Ⅱ級41例，Ⅲ級23例；腫瘤直徑：<3 cm 44例，≥3 cm 32例；發生淋巴結轉移28例，未發生淋巴結轉移48例。所有患者經病理確診、有完整的手術及隨訪病例資料(且術前未進行放化療)。同期選擇乳腺增生、乳腺纖維腺瘤31例為乳腺良性病變組，年齡35～68歲。

1.2 方法 所有乳腺組織標本均常規中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、4 μm切片。切片經二甲苯脫蠟、乙醇水化；0.01 mmol/L枸楷酸鹽緩沖液熱修復，采用免疫組化S-P法，免疫組織化學染色，DAB/H2O2顯色，蘇林精對比染色，用前列腺增生組織切片為陽性對照，PPS代替一抗為陰性對照組。PTEN(單抗1∶20)，MMP-2(單抗1∶30)，AKT(多抗1∶30)。PTEN、MMP-2單抗購自Dako公司，AKT多抗購自美國CST公司。

1.3 陽性結果判斷 采用10高倍鏡視野觀察細胞膜、細胞質著色情況，參照郭紹文等[5]文獻資料，根據著色深度(0～3分)、著色陽性細胞百分比(0～3分)，以著色深度×著色百分比≥3分作為陽性表達判斷標準。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件，PTEN、MMP-2、AKT表達等為計數資料采用χ2檢驗或秩和檢驗，PTEN與MMP-2、AKT相關性使用Pearson分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蛋白表達情況 PTEN主要定位乳腺癌細胞及上以細胞質中，偶爾也見表細胞膜與核膜。MMP-2主要定位于腫瘤細胞質，也可表達于細胞膜與細胞核中。AKT表達于細胞核。見圖1～12。

圖1 PTEN在乳腺癌組織中陽性表達(SP×200)圖2 PTEN在乳腺癌組織中陰性表達(SP×200)圖3 PTEN在乳腺良性病變組織中陽性表達(SP×200)圖4 PTEN在乳腺良性病變組織中陰性表達(SP×200)

圖5 MMP-2在乳腺癌組織中陽性表達(SP×200)圖6 MMP-2在乳腺癌組織中陰性表達(SP×200)圖7 MMP-2在乳腺良性病變組織中陽性表達(SP×200)圖8 MMP-2在乳腺良性病變組織中陰性表達(SP×200)

圖9 AKT在乳腺癌組織中陽性表達(SP×200)

2.2 PTEN、MMP-2、AKT表達 乳腺良性病變組PTEN陽性表達高于乳腺癌組，MMP-2、AKT陽性表達低于乳腺癌組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組與乳腺良性病變組PTEN、MMP-2、AKT陽性表達比較 例

2.3 PTEN、MMP-2、AKT表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 不同年齡、病理類型乳腺癌PTEN、MMP-2、AKT陽性表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；高組織學分級、腫瘤直徑≥3 cm、有淋巴結轉移、生存期<5年乳腺癌組織，PTEN陽性表達低于低組織學分級、腫瘤直徑<3 cm、無淋巴結轉移、生存期≥5年組,差異均有統計學意義(P<0.05)，MMP-2、AKT陽性表達高于低組織學分級、腫瘤直徑<3 cm、無淋巴結轉移、生存期≥5年組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征乳腺癌PTEN、MMP-2、AKT表達 例

2.4 乳腺癌PTEN表達與MMP-2、AKT相關性 Pearson相關性分析表明，PTEN表達與MMP-2、AKT表達呈負相關性(r=-0.634,-0.512,P<0.05)。見表3。

表3 乳腺癌PTEN表達與MMP-2、AKT的相關性 例

2.5 生存曲線分析 76例乳腺癌患者中，隨著時間延長，生存率呈下降趨勢。3年、5年生存率分別為77.63%、53.96%。見圖13。

圖13 76例乳腺癌5年生存率曲線圖

3 討論

乳腺癌終生發病風險高達5%[6]，2018年全球新發乳腺癌208.8萬，死亡62.7萬[7]，我國新發乳腺癌近30萬，死亡超過8萬[8]。乳腺癌的發生發展是一個多基因參與、多環節聯動、多步驟變化的復雜過程[9]，尋找有效的分子學標志物，對于早期診斷治療及預后判斷至關重要。

PTEN能靶向調節蛋白磷酸化抑制細胞生長，阻滯細胞周期于G0/G1期[10,11]。AKT通路是調節細胞增殖的重要信號通路，AKT各種因素刺激后會活化為細胞存活因子，可通過磷酸化、激活己糖激酶、降解Caspase-8活性等多種途徑抑制細胞凋亡[12]。如果PTEN陽性表達缺失，則可激活PIP-3/AKT信號通路，促進腫瘤細胞浸潤轉移[13,14]。本文研究中，乳腺癌組織PTEN陽性表達42.11%低于乳腺良性病變組87.10%，乳腺癌組織AKT陽性表達55.26%高于乳腺良性病變組織19.35%，且不同組織學分級、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移、生存期乳腺癌組織PTEN、AKT陽性表達差異均有統計學意義(P<0.05)。與梁法清等[15]文獻報道基本相似，說明乳腺癌患者PTEN抑癌基因明顯缺失，可能導致AKT過度表達。

基質金屬蛋白酶是由Ca2+、Zn2+等組成的一組金屬離子內肽酶，幾乎能夠降解細胞外基質各種蛋白成分[16]。MMP-2底物是位于細胞穿透基質突出部位的Ⅳ型膠原，能似“鉆頭”般破壞網架結構，降解細胞間基質成分及基底膜Ⅳ型膠原，打通腫瘤細胞侵襲轉移通道[17]。研究表明，MMP-2是與乳腺癌關系最為密切的基質金屬蛋白酶，其表達水平與乳腺癌浸潤生長、侵襲轉移呈正相關性[18]。本文中，乳腺癌組織中MMP-2陽性表達59.21%高于乳腺良性病變組，且不同組織學分級、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移、不同生存期乳腺癌陽性表達比較均有統計學意義，李林株等[19]在分析乳腺癌中(140例)、癌旁組織(140例)中也有類似的文獻報道，說明MMP-2異常表達與乳腺癌惡性生物學行為密切相關。

進一步分析表明，組織學分級越高、腫瘤直徑越大、發生淋巴結轉移、生存期越短，PTEN陽性表達越低，與之相反的是，MMP-2、AKT陽性表達越高。采用Pearson相關性分析表明，PTEN表達與MMP-2表達為負相關性(r=-0.634,P<0.05)，與AKT表達呈負相關性(r=-0.512,P<0.05)。可能與PTEN蛋白表達缺失負向調節AKT信號通路、AKT信號通路激活又能上調MMP-2表達等因素有關[20]。

綜上，PTEN表達缺失可能通過負向調節PI3K/AKT信號通路，誘導AKT、MMP-2過度表達，共同參與乳腺癌發生發展過程。進一步研究PTEN在乳腺癌中低表達的機制，探索激活PTEN表達的方法進而抑制或阻斷PI3K/AKT信號通路，可作為治療乳腺癌提供新思路。