基于癌癥基因組圖譜數據庫分析芳香烴受體核轉運體樣2在肺腺癌中的表達及其預后意義

陳金花 趙秋榮 尤劍彬 陳發林

福建省立醫院檢驗科，福建福州 350001

肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一。據統計，2020年全球新發肺癌患者數約為220 萬，占所有腫瘤診斷數的11.4%左右，因肺癌致死的病例數約為180 萬，占所有腫瘤死亡人數的18.0%左右[1]。肺腺癌是一種惡性上皮腫瘤，有腺樣分化和黏液分泌兩種類型，目前已成為最常見的肺癌病理類型[2-3]。

有研究[4]結果顯示，時鐘基因與多種疾病的發生、發展密切相關。在亞細胞和分子水平上，中樞和外周生物鐘由晝夜節律基因的芳香烴受體核轉運體樣2（aryl hydrocarbon receptor nuclear transporter-like 2，ARNTL2） 基因、Cry1 基因、Cry2 基因等共同組成。ARNTL2 是一種螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉錄因子并且已經被證明與多種轉錄因子具有協同作用，其中包括缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF-1α） 和核心晝夜節律轉錄因子[5-6]。近年來研究表明，時鐘基因ARNTL2 與腫瘤的侵襲性和轉移有關[7]，在乳腺癌[8]、肝癌[9]和結腸癌[10]細胞中呈高表達，且與患者預后有關。但是，ARNTL2 在肺腺癌中是否發揮作用和腫瘤發生發展中的關系有待進一步研究。因此，本研究通過癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫下載肺腺癌組織及癌旁組織RNA seq 數據及對應的肺腺癌患者臨床數據，旨在探究ARNTL2 在肺腺癌中的表達及其與肺腺癌患者預后的關系，為進一步研究ARNTL2 在腫瘤的發生發展中的作用機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數據下載

從TCGA數據庫（https：//cancergenome.nih.gov/）下載2021年3月前肺腺癌相關的RNA seq 數據及對應的肺腺癌患者臨床資料，共納入337 例肺腺癌組織（肺腺癌組）與59 例癌旁組織（癌旁對照組）。

1.2 研究方法與觀察指標

采用R 軟件3.6.2 版本將基因表達數據歸一化處理后進行log2 轉化，提取肺腺癌組與癌旁對照組的ARNTL2 表達量用于后續分析。通過R 軟件的“survival”軟件包進行生存分析，使用“survminer”軟件包繪制生存曲線。

①比較肺腺癌組與癌旁對照組的ARNTL2 表達量。②根據ARNTL2 表達量中位值將肺腺癌患者分為高表達組（＞8.59，91 例）和低表達組（≤8.59，246 例），單因素分析ARNTL2 表達量與肺腺癌患者臨床特征（年齡、性別、Stage 分期以及TNM 分期）的相關性。③分析肺腺癌患者的生存預后關系。④單因素分析ARNTL2 表達量及臨床特征（年齡、性別、Stage 分期以及TNM 分期）與肺腺癌患者預后（中位生存時間）的相關性。⑤通過Cox 比例風險模型進行多因素分析，判斷影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Wilcoxon 秩和檢驗分析ARNTL2 在分析肺腺癌組織與癌旁組織樣本中的表達；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲線評估；通過Cox 比例風險模型進行多因素分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組與癌旁對照組ARNTL2 表達量的比較

ARNTL2 在肺腺癌組中的表達高于癌旁對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 肺腺癌組與癌旁對照組ARNTL2 表達量的比較

2.2 ARNTL2 表達量與肺腺癌患者臨床特征的單因素分析

單因素分析結果顯示，肺腺癌患者的年齡、Stage分期和N 分期是影響ARNTL2 表達的相關因素（P＜0.05）（表1）。

表1 ARNTL2 表達量與肺腺癌患者臨床特征的單因素分析[n（%）]

2.3 肺腺癌患者的生存預后分析

肺腺癌患者的生存預后分析結果顯示，ARNTL2表達與肺腺癌患者總生存期存在相關性（P=0.001）（圖2）。

圖2 肺腺癌患者的生存預后分析

2.4 ARNTL2 表達量及臨床特征與肺腺癌患者預后的單因素分析

單因素分析結果顯示，Stage 分期和ARNTL2 表達是影響肺腺癌患者總生存期的相關因素（P＜0.05）（表2）。

表2 ARNTL2 表達量及臨床特征與肺腺癌患者預后的單因素分析

2.5 ARNTL2 表達量及臨床特征與肺腺癌患者預后的多因素分析

Cox 比例風險模型結果顯示，Stage 分期和ARNTL2表達是肺腺癌患者總生存期的獨立危險因素（P＜0.05）（表3）。

表3 ARNTL2 表達量及臨床特征與肺腺癌患者預后的多因素分析

3 討論

截至目前，TCGA 中總共收集33 種腫瘤約20 000個患者樣本數據，包括了基因組，轉錄組，表觀遺傳等各個組學數據[11-12]。基于TCGA 數據庫的各類癌癥相關高質量研究論文已有近3000 篇[13]。TCGA 是使用大規模測序為主的基因組分析技術，通過與其他單位廣泛的合作，分析癌癥的形成機制，從而提高人們對癌癥發病分子機制的科學認識，以及提高臨床醫生診斷、治療和預防癌癥的能力[14-15]。

肺癌是全球范圍內癌癥死亡的主要原因，嚴重危害人類健康。其中肺腺癌是目前最常見的肺癌組織學類型，所以尋找早期診斷和預后指標對肺癌的治療具有重要的意義。有研究[4]表明，時鐘基因與腫瘤的發生與發展密切相關，可以直接或間接參與改變細胞增殖，細胞凋亡和腫瘤免疫等過程。ARNTL2 在多種腫瘤中呈高表達，與結腸癌的生長、浸潤、轉移等生物學特征密切相關[7]。Polo 等[9]發現ARNTL2 表達增加與肝癌的高風險臨床病理因素之間的關聯。Wendeu-Foyet等[10]發現ARNTL2 表達增加和乳腺癌發生發展有關。Wang 等[16]在ARNTL2 在胰腺導管腺癌PDAC 組織和細胞系中高表達，與患者預后不良呈正相關。體外實驗[6-7，16]表明ARNTL2 促進PDAC 細胞增殖和侵襲能力。最新生物信息學研究發現ARNTL2 在結直腸癌組織高表達，與預后相關[17]。體外研究[18-20]發現ARNTL2通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路，進一步調控上皮間質轉化的活性，從而促進結腸癌細胞的增殖和遷移。目前，關于ARNTL2 在肺腺癌中的表達模式及其作用還未明確[21]。本研究結果顯示，ARNTL2 在肺腺癌組中的表達高于癌旁對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；單因素分析結果顯示，肺腺癌患者的年齡、Stage 分期和N 分期是影響ARNTL2 表達的相關因素（P＜0.05）；生存預后分析結果顯示，ARNTL2 表達與肺腺癌患者總生存期存在相關性（P＜0.05）；單因素分析結果顯示，Stage 分期和ARNTL2 表達是影響肺腺癌患者總生存期的相關因素（P＜0.05）；Cox 比例風險模型結果顯示，Stage 分期和ARNTL2 表達是肺腺癌患者總生存期的獨立危險因素（P＜0.05）。上述結果提示ARNTL2 可能是肺腺癌的潛在生物標志物，在腫瘤發生發展過程中發揮了重要作用。

綜上所述，通過分析TCGA 數據庫中肺腺癌的數據，可知ARNTL2 在肺腺癌中高表達且與臨床特征具有相關性，可以推測ARNTL2 在肺腺癌的發生發展中發揮了重要作用，進一步影響肺腺癌患者的預后。因此，ARNTL2 可作為肺腺癌潛在預后標志物或治療靶點，接下來可以進一步收集臨床樣本進行驗證，為研究肺腺癌發生發展的分子機制提供參考。