電針對骶髓損傷后神經源性膀胱尿潴留大鼠尿動力學的影響和機制研究

胡映秋 王開陽 扶流祥 吳利東 徐美玲

1.南昌大學第二附屬醫院急診科，江西南昌 330000；2.南昌大學第二附屬醫院泌尿外科，江西南昌 330000

骶髓損傷后神經源性膀胱指的是骶段脊髓病變、腰椎病變引起脊髓損傷導致損傷骶髓初級排尿中樞，或者是由于臨近體神經與副交感神經病變導致的膀胱功能障礙，具體表現包括逼尿肌無反射，膀胱容量逐漸擴大，尿液無法正常排出[1]。這一膀胱功能障礙使膀胱組織細胞形態學出現病理層面的改變，可能繼發尿路反復性感染，嚴重情況下還可能出現腎衰，被認為是脊髓損傷病死的主要原因[2]。因此針對骶髓損傷后神經源性膀胱尿潴留，需要重視改善其尿動力學狀況，提高膀胱功能。中醫將尿潴留納入“癃閉”范疇，針灸作為中醫傳統療法，被證實可對膀胱功能形成雙相調節，還能有效抗泌尿系感染[3]。一項動物實驗研究發現，對該病模型大鼠給予電針治療能增強其逼尿肌興奮程度，提高膀胱收縮張力，幫助膀胱排尿功能得以重建[4]。本研究選擇30 只雄性SD 大鼠，分為三組后分析電針治療的應用價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

10%水合氯醛，手術臺，微型蚊式鉗，眼科剪，慶大霉素（宜昌人福藥業有限責任公司，國藥準字H42022058），電針治療儀（安陽市翔宇醫療設備有限責任公司，XYD-Ⅲ型，產品標準編號：YZB/豫0050-2009），F3 導管，微量灌注泵，多通道生理記錄儀[ADInstruments POWERLAB，藥（械）準 字：20153212513]，Primer-BLAST，TRIzol 試劑（上海恪敏生物科技有限公司），反轉錄試劑盒[金克隆（北京）生物技術有限公司，規格：50T RE0510]，據蛋白質定量試劑盒（BCA）[北京庫爾科技有限公司，批準文號：京藥監械（準）字2011 第2400737 號]，5%脫脂奶粉 （石家莊君樂寶乳業有限公司），Western 洗滌緩沖液（TBST）（上海聯邁生物工程有限公司，貨號：LM-2925）。

1.2 實驗動物及分組

材料：選擇30 只健康成年雄性SD 大鼠作為本研究材料，大鼠均為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別，體重250～300 g，均采購于本地區實驗動物中心，有正規實驗動物使用許可證，許可證號：SYXK（贛）2020-0016。本研究整個動物實驗過程均與動物倫理委員會標準相符合。

分組：按照隨機數字表法選擇其中10 只作為對照組，另外20 只建立骶髓損傷后神經源性膀胱尿潴留模型，建模成功后再將這20 只大鼠隨機分為模型組（10 只）和電針組（10 只）。

1.3 方法

1.3.1 建模 根據脊髓橫斷法進行模型制備，具體操作如下。選擇10%水合氯醛行腹腔注射進行麻醉處理，將大鼠放置為俯臥位固定在手術臺。骨性標志選定為連接第13 浮肋的T13，向上以此類推，完成T10的定位，并進行備皮處理，碘伏消毒后于后正中線從T8 到T12作縱向切口。將皮膚切開并逐層進行鈍性分離處理，將T9到T11共3 個棘突以及橫突暴露出來。將橫突通過鑷子夾住并固定，選擇微型蚊式鉗T10椎板咬除，將2 mm 直徑的脊髓暴露出來，迅速通過眼科剪將脊髓剪斷，之后迅速能觀察到大鼠兩下肢有抽搐反應，尾巴會甩動，接著會徹底松弛。止血后將各層按順序關閉，選擇慶大霉素涂抹傷口。

1.3.2 建模成功標準 建模24 h 之后能觸及膀胱隆起，且脊髓損傷的行為學評分（Basso-Beattie-Bresnahan，BBB）評分[5]結果為0 分，前肢可行走，后肢處于拖動狀態。本研究20 只大鼠均成功建模。建模后大鼠均保持單籠飼養，飼養溫度恒定37℃，予其自由飲水、進食，每天按壓其膀胱幫助其排尿以及排便，頻率2～3 次/d，另外每天選擇20 萬U 青霉素進行腹腔注射進行傷口感染預防，持續使用1 周。

1.3.3 治療 對照組不給予治療，模型組不給予治療，電針組以次髎、三陰交以及中極為穴位進行針刺治療，穴位定位：次髎穴處于第2 骶后孔部位直刺15 mm 左右，中極穴處于神闕穴與恥骨聯合上緣連線的上4/5 與下1/5 的交點平刺5 mm，三陰交穴位處于后肢內踝尖直上方1 cm 部位直刺5 mm。電針刺激通過電針治療儀進行，疏密波分別設置為10、50 Hz，相應工作5、9 s，以大鼠肢體輕微顫動為宜。針刺雙側次髎穴位時左側與正極連接，右側與負極連接，針刺中極穴位時與負極連接，針刺三陰交穴位時與正極保持連接，并且進行三陰交針刺時應該保持左右側交替取穴。每天治療1 次，每次治療時間持續20 min，持續治療1 周。

1.4 觀察指標

采集及處理標本：所有大鼠均在結束尿動力學檢查后，通過水合氯醛實施腹腔麻醉，中心點選定為L2～L3椎間隙，取其上、下分別1 cm 左右位置的脊髓組織，通過生理鹽水將取下的脊髓組織清洗干凈，置于-80℃溫度下保存待用。

尿動力學評價：所有大鼠完成麻醉處理后，將膀胱排空，將F3 導管置入尿道，連接微量灌注泵、多通道生理記錄儀，保持0.1 ml/min 的恒定速度灌注恒溫生理鹽水，將各組大鼠膀胱最大容量、膀胱基礎壓、漏尿點壓力、膀胱順應性記錄下來。

PCR 試驗：根據基因庫（GenBank）中大鼠熱休克蛋白20（heat shock proteins-20，HSP-20）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）、BCL2-Associated X 蛋白質（BCL2-Associated X protein，Bax）、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、叉頭框蛋白O1 （forkhead box protein O1，FOXO1）、β-actin 的mRNA 序列，通過Primer-BLAST 完成PCR 引物的設計。依據試劑說明書通過TRIzol 試劑相應提取三組大鼠脊髓組織的總RNA，通過反轉錄試劑盒反轉錄將RNA 為互補cDNA，繼續依據說明書通過SYBR Green Ⅰ染料法完成定量PCR 試驗。PCR 反應程序：95℃下進行0.5 min 預變性；94℃變性5 s，60℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min（上述3 個溫度擴增40個循環）；最后72℃下進行10 min 延伸。實驗共進行3次，以3 次平均值記錄為最終結果。

Western blot 試驗：稱量50 mg 脊髓組織樣品，勻漿處理，留心處理后留取上層清液，根據BCA 法說明書測定蛋白濃度，5×Loading buffer 混合均勻，行持續5 min 的沸水浴。每泳道上樣蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠、濕法轉膜，接著浸泡在5%脫脂奶粉中，室溫環境下靜置1 h 左右。之后把膜、一抗放在4℃冰箱中進行過夜孵育，1×TBST 進行3 次清洗，每次清洗持續10 min。接著選擇1×TBST 稀釋的二抗放在37℃環境下進行1 h 孵育，繼續用1×TBST 進行3次清洗，每次清洗持續15 min。顯色曝光后掃描底片，對蛋白灰度進行統計分析。

1.5 統計學方法

利用SPSS 23.0 分析所有數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，三組比較采用ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組尿動力學的比較

三組的膀胱順應性、漏尿點壓力、膀胱基礎壓、膀胱最大容量結果比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、電針組的上述指標均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組上述指標結果均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 三組大鼠尿動力學的比較（±s）

表1 三組大鼠尿動力學的比較（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；1 cmH2O=0.098 kPa

對照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 0.09±0.01 0.19±0.02a 0.13±0.01ab 5.462 0.000 38.89±2.21 52.16±4.17a 44.18±3.19ab 6.819 0.000 26.03±2.19 29.73±2.38a 27.15±2.47ab 5.378 0.000 1.18±0.13 4.40±0.36a 2.30±0.21ab 8.814 0.000組別 例數 膀胱順應性（ml/cmH2O）漏尿點壓力（cmH2O）膀胱基礎壓（cmH2O）膀胱最大容量（ml）

2.2 三組大鼠HSP20、PTEN 的mRNA 表達的比較

三組HSP20、PTEN 的mRNA 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平均低于對照組，PTEN 的mRNA水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組大鼠脊髓組織PTEN 的mRNA 水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠脊髓組織HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比較（±s）

表2 三組大鼠脊髓組織HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比較（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

對照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 1.70±0.39 0.68±0.16a 1.22±0.30ab 7.182 0.000 0.86±0.21 2.33±0.56a 1.50±0.35ab 11.057 0.000組別 例數 HSP20 mRNA PTEN mRNA

2.3 三組大鼠Akt 活化及凋亡通路mRNA 表達的比較

三組Bax、FOXO1、Bcl-2、Caspase-9、Akt 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、電針組Bcl-2、Akt 水平均低于對照組，Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05）；電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型組，Bcl-2 高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組、模型組Akt 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 三組大鼠脊髓組織Akt 通路凋亡相關因子mRNA 水平（±s）

表3 三組大鼠脊髓組織Akt 通路凋亡相關因子mRNA 水平（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

對照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 0.28±0.06 1.31±0.33a 0.94±0.22ab 7.593 0.000 0.92±0.21 2.56±0.63a 1.48±0.37ab 6.832 0.000 1.51±0.33 0.62±0.15a 1.12±0.27ab 7.924 0.000 0.85±0.21 1.67±0.41a 1.19±0.29ab 10.057 0.000 1.06±0.13 1.01±0.11a 1.00±0.10a 3.054 0.019組別 例數 Bax FOXO1 Bcl-2 Caspase-9 Akt

3 討論

中醫將尿潴留納入“癃閉”范疇，認為其發生是由于腎氣不足，膀胱氣化失司，三焦無法通調水道而起[6]。本研究電針組治療選擇的穴位為次髎、中極以及三陰交穴，其中次髎為膀胱經穴位，不僅為局部取穴，也是膀胱病變治療的常用穴位。中醫典籍中有“次髎，主大小便不利”；三陰交穴是足三陰經交會穴，足三陰經循行少腹或陰器，有通調下焦氣機的作用，可對膀胱功能起到調節作用[7]。中極穴是膀胱募穴，屬于足三陰與任脈之會，中醫中六腑病變取穴治療多取此處穴位，中極穴被認為是膀胱病變治療的重要穴位[8]。

從排尿反射神經通路這一層面來看，排尿中樞處在骶叢神經，次髎穴下有支配盆腔臟器的骶神經，對這一穴位進行針刺治療能將與排尿相關的傳入與傳出神經激活，還能經傳入神經元向高級中樞傳導刺激，激發逼尿肌、膀胱內括約肌節律性收舒運動，最終建立并完成排尿反射[9]。三陰交穴位下通過著L4~S3神經根的脛神經，且深層有L5、S1神經節段，淺層有屬于L4神經節段的隱神經，通過對這一穴位進行刺激治療能經反射弧傳至脊髓后根，對腰骶部排尿中樞有激發作用，可促進反射性排尿[10]。研究對三陰交、次髎等穴位進行針刺治療，顯示患者尿道括約肌舒縮功能、膀胱運動功能均有明顯改善，同時膀胱最大容量明顯下降，殘余尿量明顯減少[11-12]。中極穴處在膀胱局部，是支配膀胱、直腸的神經分支-髂腹下神經，對這一穴位進行針刺治療能對膀胱產生刺激，促使膀胱逼尿肌收縮，幫助膀胱皺襞能再次皺縮，促進排尿反射，生成尿意[13]。研究對關元與中極穴進行電針治療，顯示電針可經自主神經刺激傳入神經，對膀胱活動形成調節，并能幫助恢復膀胱功能[14-15]。

本研究電針組治療后膀胱最大容量、漏尿點壓力、膀胱順應性均較模型組明顯下降，接近對照組水平，提示電針治療能改善脊髓損傷尿潴留患者的排尿中樞功能，促使膀胱逼尿肌彈性提升，能幫助逼尿肌反射逐漸恢復，并維持正常收縮功能，減低膀胱最大容量，減少殘余尿量，進而使膀胱功能得到改善。本研究電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組大鼠脊髓組織PTEN 的mRNA 水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），證實HSP20 上升、PTEN 下降能提高Akt 活性，表明電針治療對脊髓損傷尿潴留的作用機制可能與HSP20、PTEN 水平具有緊密聯系。另外本研究顯示模型組、電針組Bcl-2、Akt 水平均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組、電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型組，Bcl-2 高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組、模型組Akt 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示接受電針治療能提升Akt 活性，并會對下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、FOXO1 的表達產生影響，對細胞凋亡發揮抑制作用。上述結果表明，骶髓損傷后神經源性膀胱尿潴留會加快細胞凋亡，神經細胞受損，因此脊髓、膀胱功能會受到影響，膀胱排尿功能變得異常，最終引發尿潴留[16]。通過實施電針治療，能加快HSP20表達，促進其磷酸化轉變，對PTEN 表達產生抑制，并提升Akt 活性，提升下游Bcl-2 水平，對凋亡因子包括Bax、Caspase-9、FOXO1 的表達產生抑制，形成對細胞凋亡的抑制作用，最終幫助恢復部分脊髓神經功能，并使神經中樞對膀胱組織的調控得以提升，使逼尿肌、括約肌的功能以及膀胱內壓維持在正常水平，使膀胱排尿功能、收縮功能得以改善，最終能使尿潴留癥狀逐漸減輕[17-18]。

綜上所述，電針治療骶髓損傷后神經源性膀胱尿潴留大鼠能改善其尿動力學，具體作用機制考慮與抑制PTEN 表達、促進HSP20 磷酸化與表達，并進一步抑制凋亡通路、提高Akt 活性相關。