CYP3A4、PXR和IL-10基因多態(tài)性對43名中國健康受試者空腹及餐后口服氨氯地平藥代動力學特征的影響

劉林林 阿薩亞 劉建芳 陳 琳 劉 丹 謝宏波 劉名義 夏春華▲

1.南昌市洪都中醫(yī)院臨床試驗機構，江西南昌 330038；2.南昌大學臨床藥理研究所，江西南昌 330031；3.江西省皮膚病?？漆t(yī)院藥劑科，江西南昌 330000

氨氯地平選擇性抑制鈣離子跨膜進入心肌細胞或平滑肌細胞，有效降低血管收縮力，臨床廣泛用于治療高血壓和缺血性心臟病[1]。但氨氯地平的治療效果常具有明顯的個體差異[2]，藥物代謝酶的基因多態(tài)性常常被認為是其重要影響因素之一。氨氯地平主要經(jīng)細胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）酶進行代謝[3]，它在不同個體中的表達水平以及酶活性也都顯示出明顯的種族異質性和個體差異，極大地影響了治療結果[4-5]，常常導致治療失敗，甚至嚴重的藥物毒副作用。其本身的遺傳多態(tài)性是藥物代謝個體間差異的主要來源[6-8]。此外，孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）的基因多態(tài)性也是導致CYP3A4 在不同人群中差異的重要因素之一[9-11]，而白介素-10（interleukin-10，IL-10）則有研究表明，在給予健康受試者IL-10 后，CYP3A4 的活性約降低12%[12]，表明CYP3A4 的基因多態(tài)性可直接影響或通過PXR 或IL-10 基因多態(tài)性改變CYP3A 酶系的活性，從而間接影響氨氯地平的藥代動力學過程。本研究旨在探討CYP3A4、PXR 和IL-10 基因多態(tài)性對43 名中國健康受試者空腹及餐后單次口服氨氯地平藥代動力學特征的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本臨床研究完成于2015年，并獲得醫(yī)學倫理委員會的批準{[2014]倫理審第（050）號}，所有受試者均在篩選前簽署知情同意書，共有43 名中國籍健康男性受試者入組此項研究，年齡18～40 歲，平均（23.1±1.6）歲；體重指數(shù)（body mass index，BMI）19～24 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2，所有受試者試驗前經(jīng)一般體格檢查、詢問既往用藥史、實驗室檢查（檢查項目包括血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能等）以及心電圖檢查，未發(fā)現(xiàn)異常，身體狀況良好，均無煙酒嗜好，在試驗前2 周內未服用過任何其他藥物。

1.2 方法

受試者按隨機數(shù)字表法分為空腹組和餐后組，分別在空腹狀態(tài)和高脂高熱量飲食后30 min 單劑量交叉口服給予10 mg 苯磺酸氨氯地平片（北京天然藥物研究所平衡南洋制藥廠；生產(chǎn)批號：19-131104；規(guī)格：10 mg/片），分別于給藥前和給藥后2、4、5、6、7、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h 共16 個時間點采集4.0 ml 上肢靜脈血，分離取上層血漿樣品放置于-80℃冰箱冷凍避光保存，兩試驗周期之間設兩周的清洗期。血樣中氨氯地平的濃度通過液相二級質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）方法進行測定。

1.3 基因分型

使用DNA 純化試劑盒（北京全式金）提取外周血基因組DNA，然后采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法對CYP3A4（13989A>G、15820C>G、17776Ainsertion）、PXR（24381A>C、3'UTR10719G>A、3'UTR11193T>C）和IL-10（1082G>A、819C>T、592C>A）進行基因分型。PCR 反應體系共25 μl，包含2×Easy Taq＠PCR SuperMix 12.5 μl，正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，ddH2O 6.5 μl，基因組DNA 5 μl。PCR 反應程序設置如下：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30 個循環(huán)，72℃延伸7 min，擴增后的產(chǎn)物37℃消化2 h，PCR 最終產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳條帶分析。

1.4 血漿中氨氯地平的檢測

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Lunna-C18柱（50 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相：2 mmol/L 甲酸銨（PH3.0）:乙腈=65∶35（v/v）；流速：400 L/min。

1.4.2 質譜條件 離子化方式：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI+）；監(jiān)測方式：多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化器壓力（Gas1）：40 psi；離子化電壓：5500 V；檢測離子：m/z 409.1→238.0（氨氯地平）以及m/z 480.2→315.0（內標物尼卡地平）。

1.4.3 血漿樣品處理方法 有機溶劑液液萃取法。取200 μl 待測血漿，精密加入20 μl 內標（1.0 ng/ml）和20 μl 空白溶劑，再加入20 μl 氫氧化鈉溶液（1 mol/L），以及1000 μl 叔丁基甲醚，渦旋振蕩3 min，15 000 r/min離心5 min，離心半徑8.2 cm，分層，取上層清液850 μl置于濃縮揮干儀中45℃減壓干燥約20 min，殘渣用200 μl 流動相進行復溶，渦旋振蕩3 min，20 000 r/min離心5 min，離心半徑8.2 cm，取上層清液100 μl 進行分析測定。血漿中的氨氯地平在0.05～16.2 ng/ml 范圍內線性關系良好，檢測方法無明顯的基質效應，低、中、高濃度的提取回收率＞85%，批間、批內精密度與準確度均符合要求[13]。

1.5 藥物代謝動力學分析

本研究中血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS 2.1 軟件以非房室模型對氨氯地平在體內的藥動學參數(shù)進行估算分析，藥動學參數(shù)主要包括峰濃度（cmax），達峰時間（Tmax），半衰期（t1/2）和藥時曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 進行χ2檢驗判定各基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 受試者的一般資料

空腹組最終完成試驗的男性健康受試者22 名，年齡21～24 歲，平均（22.0±0.8）歲；身高162～178 cm，平均（169.9±4.4）cm；體重52.0～75.0 kg，平均（61.8±6.9）kg；體重指數(shù)19.0～23.9 kg/m2，平均（21.4±1.8）kg/m2。餐后組入組健康男性受試者22 名，最終完成試驗者有21 名，年齡22～28 歲，平均（24.0±1.5）歲；身高168～180 cm，平均（171.6±4.1）cm；體重51.1～74.3 kg，平均（63.0±5.8）kg；體重指數(shù)19.2～24.0 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2。兩組受試者的年齡、身高、體重和BMI 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 43 名受試者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點基因分型結果

本研究通過PCR 方法對CYP3A4、PXR 和IL-10進行基因分型，結果顯示CYP3A4 在17776 A insertion、15820C>G、13989A>G 位點的突變頻率分別為11.6%（5/43）、20.9%（9/43）、16.5%（7/43），PXR 在24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A 位點的突變頻率分別為27.9%（12/43）、25.5%（11/43）、18.6%（8/43），IL-10 在592C>A、819C>T、1082G>A 位點的突變頻率分別為18.6%（8/43）、23.2%（10/43）、11.6%（5/43）。對上述基因型進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，結果均顯示P＞0.05，基因型符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.3 43 名受試者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點間的關聯(lián)性分析

通過對CYP3A4、PXR、IL-10 三個基因突變的相互影響的關聯(lián)性分析，結果顯示IL-10 突變與PXR突變呈明顯相關性，其他基因之間關聯(lián)性不大（表1），IL-10 突變引起PXR 突變的概率為71.4%，不引起PXR 突變的概率為28.6%。

表1 43 名受試者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點間的關聯(lián)性分析[n（%）]

2.4 兩組藥物代謝動力學參數(shù)的比較

CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突變位點對空腹及餐后口服氨氯地平的受試者體內主要藥動學參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2或cmax）均無顯著影響（P＞0.05）（表2）?？崭菇M和餐后組的氨氯地平藥動學參數(shù)差異結果顯示，餐后組的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹組，差異有統(tǒng)計學意義（表3）。

表2 CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突變位點對口服氨氯地平的43名受試者體內主要藥動學參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2 或cmax）影響的方差分析結果

表3 空腹組和餐后組口服給予10 mg 氨氯地平后藥代動力學參數(shù)的比較（s）

表3 空腹組和餐后組口服給予10 mg 氨氯地平后藥代動力學參數(shù)的比較（s）

與空腹組比較，aP＜0.05

空腹組餐后組43.40±9.32 42.75±7.57 4.18±0.73 5.17±1.83a 6.18±1.84 7.71±4.36 212.09±40.53 291.20±92.02a 228.57±52.37 313.21±103.47a組別 t1/2（h）cmax（ng/ml）Tmax（h）AUC0-t（ng·h/ml）AUC0-∞（ng·h/ml）

3 討論

氨氯地平是臨床上常用的降壓藥之一，在體內主要經(jīng)肝臟CYP3A4 酶系代謝，其療效在個體間存在顯著差異，可能與藥物代謝酶CYP3A4 的基因多態(tài)性有關。儲小曼等[14]發(fā)現(xiàn)CYP3A4*4、*5、*6 等位基因的存在可能降低藥物代謝酶CYP3A4 的活性，從而影響環(huán)孢素A 在體內的代謝過程，CYP3A4*4、*5、*6 分別對應13989A>G、15820C>G、17776 A insertion 三個突變位點。CYP3A4 受多種轉錄因子的調控，其中PXR 被認為是最關鍵的轉錄因子，其基因多態(tài)性可能間接影響CYP3A4 的表達水平[11，15]。雖然在PXR 中發(fā)現(xiàn)了許多單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs），并且似乎影響PXR 功能，但是其對人類受試者中CYP3A4 表達的影響還未深入研究[10]。另一方面，IL-10 是一類抗炎細胞因子，影響基因轉錄和蛋白質合成，也能參與調節(jié)CYP3A4 的酶活性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 存在的3 個SNPs，即1082G>A、819C>T和592C>A 可能與IL-10 表達降低相關[17]。因此，本研究探討CYP3A4-（Exon-917776A）、CYP3A4-（Exon7-15820C>G）、CYP3A4-（Exon5-13989A>G）；PXR-（Exon1-24381A>C）、PXR-（3'-UTR11193T>C）、PXR-（3'-UTR10719G>A）；IL-10-（592C>A），IL-10-（819C>T），IL-10-（1082G>A）9 個突變位點對氨氯地平藥代動力學特征的影響。

本研究結果顯示，三個CYP3A4 基因型、三個PXR 基因型和三個IL-10 基因型對氨氯地平在體內的藥動學參數(shù)無明顯影響（P＞0.05）。Guo 等[18]研究基因多態(tài)性因素對高血壓患者氨氯地平藥代動力學過程的影響時發(fā)現(xiàn)CYP3A4*1G 和CYP3A5*3 的基因多態(tài)性對氨氯地平血藥濃度無影響（P>0.05），與本研究在健康受試者中所獲得的結果相一致。在CYP3A4 所發(fā)現(xiàn)的39 個突變位點中，絕大多數(shù)位點的突變不會改變酶的活性，僅有少數(shù)位點上的突變能影響酶的活性[1]。本研究中未能觀察到CYP3A4、IL-10 和PXR 的基因突變體對氨氯地平藥代動力學過程有明顯的作用，可能存在以下幾方面的原因：首先，本研究中選取突變位點對氨氯地平的藥代動力學影響輕微，PXR 或IL-10 上可能存在著其他調控作用比較明顯的SNPs；其次，藥物代謝過程受到一些其他因素如年齡、身體生理狀況等的影響；最后，除了基因方面的影響，PXR對內源性、外源性物質的接觸也會影響CYP3A4 的表達。因此，需要進一步探討更多的影響因子，為臨床指導CYP3A4 代謝底物合理應用提供可靠的理論基礎。

另外，本研究對43 名受試者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點相關性進行比較分析，結果顯示，IL-10 和PXR 突變頻率呈明顯相關性，IL-10 的突變顯著增加PXR 突變的頻率，提示IL-10 可能通過作用于PXR 來調控CYP3A4 的表達。但是PXR 和CYP3A4 之間的突變無明顯的相關性，可能是因為所選取PXR 和CYP3A4 的突變位點之間僅僅是弱相關，或者是本研究受試者數(shù)量不足導致的。

本研究還探討飲食因素對氨氯地平體內藥代動力學的影響，結果顯示，餐后組的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示高脂高熱量飲食可明顯增加口服途徑給予的氨氯地平的體內血藥濃度及其暴露量。一般來說，食物容積、溫度以及食物中所含營養(yǎng)成分及其熱量均有可能改變胃腸道的內環(huán)境，從而改變藥物在胃腸道停留的時間以及藥物在胃腸道液中的溶解度和滲透性，而高脂高熱量食物更能影響胃腸道的理化功能，從而更能改變藥物或制劑的生物利用度。飲食對氨氯地平血藥濃度的影響可能產(chǎn)生一些嚴重的后果，需要在臨床實踐使用過程中加以關注。

綜上所述，CYP3A4（17776 A insertion、15820C>G、13989A>G）、PXR（24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A）和IL-10（592C>A、819C>T、1082G>A）共9 個位點的突變體對43 名中國健康受試者體內氨氯地平的藥代動力學過程無顯著影響，但飲食因素可能會明顯提高氨氯地平在人體內的吸收。