超高壓液相色譜-串聯質譜法測定速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺的含量

郇志博,段 云,徐 志,王明月,羅金輝,田 海,張利強,韓丙軍

(1.中國熱帶農業科學院 分析測試中心,?？?571101; 2.海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室,海口 571101;3.農業農村部熱作產品質量安全風險評估實驗室,?？?571101; 4.海南省院士工作站,?？?571101)

丙烯酰胺被國際癌癥研究機構(IARC)列為2A類致癌物,即“人類可能致癌物”[1]。2002年瑞典科學家發現富含淀粉的高溫熱加工食品(如餅干、薯條等)中含有大量的丙烯酰胺[2];2018年,全球咖啡行業因美國加州法院裁定星巴克咖啡中含有“可能致癌”的丙烯酰胺而遭受巨大影響。因此,監測食品中丙烯酰胺的含量對保障消費者的食品安全具有重要意義。

2014年我國發布了國家標準GB 5009.204－2014《食品安全國家標準 食品中丙烯酰胺的測定》,該標準建立了穩定性同位素稀釋的液相色譜-串聯質譜法和穩定同位素稀釋的氣相色譜-串聯質譜法兩種方法來測定熱加工(如煎、炙烤、焙烤等)食品中丙烯酰胺的含量。同時,國內外也報道了許多關于食品中丙烯酰胺的測定方法:文獻[3]采用高效液相色譜法測定曲奇餅干中丙烯酰胺的含量;文獻[4]采用高效液相色譜-四極桿質譜法測定餅干中丙烯酰胺的含量;文獻[5]采用QuECh ERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定咖啡中丙烯酰胺;文獻[6]采用超高效液相色譜-大氣壓化學電離-串聯質譜法測定烘焙咖啡中丙烯酰胺。

國家標準GB 5009.204－2014推薦的測定方法前處理操作步驟復雜,耗時較長,無法對大批量樣品進行分析[6]。另外,前期試驗發現,速溶咖啡和曲奇餅干兩種樣品的基質差異較大,曲奇餅干中含有較多的油脂成分,而速溶咖啡中含有較多的極性成分,目前的參考文獻和國家標準難以同時快速、準確地測定兩種基質中丙烯酰胺的含量。因此,本工作在前期研究的基礎上,通過優化色譜條件和凈化方法,建立了超高壓液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)同時測定速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX TRIPLE QUADTM6500＋型超高壓液相色譜-串聯質譜儀;T25型勻漿機;Milli-Q型超純水器;CR22GIII型高速冷凍離心機;SENCO型旋轉蒸發儀。

丙烯酰胺標準儲備溶液:100 mg·L－1。

內標(13C3-丙烯酰胺)儲備溶液:100 mg·L－1。

丙烯酰胺標準溶液:5.00 mg·L－1,移取0.5 mL的丙烯酰胺標準儲備溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,配制成5.00 mg·L－1的丙烯酰胺標準溶液。使用時,用水稀釋至所需質量濃度。同法制得5.00 mg·L－1的內標溶液。

甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Aglient Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫30℃;進樣體積1μL;流動相為5%(體積分數,下同)甲醇溶液,流量0.15 mL·min－1,等度洗脫。

2)質譜條件 電噴霧離子(ESI)源,正離子掃描;多反應監測(MRM)模式;噴霧電壓5 500.0 V;離子源溫度550.0℃;霧化氣壓力379 Pa,加熱氣壓力379 Pa,氣簾氣壓力276 Pa,碰撞室壓力55.2 Pa;碰撞室入口電壓和出口電壓均為10.0 V;駐留時間100.0 ms。

丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的質譜參數見表1,其中,“*”代表定量離子。

表1 丙烯酰胺與13 C3-丙烯酰胺的質譜參數Tab.1 MS parameters of acrylamide and 13 C3-acrylamide

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取

分別稱取2.0 g速溶咖啡粉末和曲奇餅干樣品粉末于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,以轉速3 000 r·min－1勻質1 min,再于4℃以轉速9 000 r·min－1離心3 min,將上清液轉移至新的離心管中。在殘渣中再加入10 mL乙腈,渦旋30 s,于4℃以轉速9 000 r·min－1離心3 min,合并兩次上清液。在上清液中加入10 mL正己烷,渦旋2 min,于4℃以轉速9 000 r·min－1離心3 min,除去上層正己烷相,再次加入10 mL正己烷,重復操作,除去上層正己烷相。

1.3.2 樣品凈化

取10 mL下層乙腈相于50 mL圓底燒瓶中,于40℃減壓濃縮至近干,加入1 mL水溶解,經0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件,對丙烯酰胺質量濃度均為0.05 mg·L－1的丙烯酰胺標準溶液、曲奇餅干空白樣品加標溶液和速溶咖啡空白樣品加標溶液進行測定,所得提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 樣品的提取

不同的提取和凈化方法對樣品的測定結果有很大影響。國家標準GB 5009.204－2014和文獻[4,7-8]直接用水作為餅干中丙烯酰胺的提取劑,然后用正己烷除脂;文獻[6]以甲醇為提取劑,提取咖啡中的丙烯酰胺;文獻[9-10]以乙腈-水混合液為提取劑;文獻[11]單獨使用乙腈為提取劑。試驗分別以水、乙腈-水混合液、甲醇、乙腈為提取劑,用正己烷除脂,考察了上述提取劑對速溶咖啡和曲奇餅干樣品中丙烯酰胺提取效果的影響。結果表明:以水為提取劑時,水與咖啡粉末形成懸濁液,難以通過離心獲得上清液,嚴重影響凈化步驟;以乙腈-水混合液為提取劑時,乙腈和水容易分層,而且丙烯酰胺在兩相中均有溶解,造成測定結果不準確;以甲醇為提取劑時,甲醇極性較強,導致提取液中含有大量的極性干擾物質,與丙烯酰胺難以分開;以乙腈為提取劑時,速溶咖啡和曲奇餅干中的丙烯酰胺均可被較好提取。因此,試驗選擇以乙腈為提取劑,用正己烷除脂。

2.2.2 樣品的凈化

按照試驗方法提取樣品,參考國家標準GB 5009.204－2014和相關文獻[4,11-12]設計了4種凈化方法:① 取10 mL下層乙腈相于50 mL圓底燒瓶中,于40℃減壓濃縮至近干,加入1 mL水溶解,經0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定;② 取10 mL下層乙腈相,采用Oasis HLB(500 mg/6 mL)和Bond Elut-AccuCAT(200 mg/6 mL)固相萃取小柱凈化,凈化過程參照國家標準GB 5009.204－2014,最后加入1 mL水溶解,經0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定;③取10 mL下層乙腈相,采用經3 mL甲醇和3 mL水活化的HLB固相萃取小柱凈化,收集流出液,再用3 mL水洗脫,收集全部洗脫液,在氮氣下將流出液濃縮至近干,最后用1 mL水溶解,經0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定;④ 取10 mL下層乙腈相,加入0.2 g N-丙基乙二胺,充分振蕩,于4℃以轉速9 000 r·min－1離心3 min,將上清液全部轉移至50 mL圓底燒瓶中,于40℃蒸發濃縮至近干,加入1 mL水溶解,經0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定。試驗考察了上述4種凈化方法對速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺回收率的影響(加標量均為0.1 mg·kg－1),并計算測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表2。

結果表明:經方法②處理后,速溶咖啡和曲奇餅干中基本檢測不到丙烯酰胺,回收率僅為0.5%和0.2%;經方法③和方法④處理后,丙烯酰胺的峰形較差且回收率較低;經方法①處理后,速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺的回收率分別為99.6%和111%。因此,試驗選擇方法①來凈化樣品。

2.3 色譜條件的優化

丙烯酰胺屬于強極性物質,在C18色譜柱上的保留時間較短,容易受基質干擾[7]。為了獲得最佳的分離效果,試驗參照國家標準及相關文獻[6-7,11-15],考察了不同流動相體系[甲醇-水、甲醇-0.1%(體積分數)甲酸溶液、乙腈-水]對曲奇餅干和速溶咖啡樣品中丙烯酰胺分離效果的影響。結果顯示:對于曲奇餅干樣品,不同流動相體系均能較好地分離丙烯酰胺;而對于速溶咖啡樣品,不同流動相體系對丙烯酰胺分離效果的影響較大;當以甲醇-水體系為流動相時,速溶咖啡中的丙烯酰胺可被較好地分離。因此,試驗選擇甲醇-水體系為流動相。

試驗進一步考察了體積分數為5%,10%,20%的甲醇溶液在流量為0.20 mL·min－1以及體積分數為5%的甲醇溶液在流量為0.10,0.15,0.20 mL·min－1時對曲奇餅干和速溶咖啡樣品中丙烯酰胺分離效果的影響。

結果表明:對于曲奇餅干樣品,當流量為0.20 mL·min－1時,甲醇體積分數的改變對分離丙烯酰胺的影響較小;當流動相為5%甲醇溶液時,隨著流量的減小,丙烯酰胺與雜質峰的分離情況基本保持不變,說明甲醇體積分數和流量對曲奇餅干樣品中丙烯酰胺的分離效果影響均不大。

對于速溶咖啡樣品,當流量為0.20 mL·min－1時,隨著甲醇體積分數的減小,丙烯酰胺與雜質峰的分離度逐漸增大[圖2(a)、(b)和(c)];當流動相為5%甲醇溶液,流量為0.15 mL·min－1時,速溶咖啡樣品中丙烯酰胺的分離效果較好[圖2(d)],無肩峰和拖尾,且響應值較高。因此,試驗最終選擇流動相為5%甲醇溶液,流量為0.15 mL·min－1,以分離曲奇餅干和速溶咖啡樣品中的丙烯酰胺。

2.4 質譜條件的優化

分別取 1 mL 0.10 mg·L－1的丙烯酰胺(CH2＝CH－CO－NH2)和13C3-丙烯酰胺(13CH2＝13CH－13CO－NH2)標準溶液,經針泵進質譜儀。由于丙烯酰胺帶有一個氨基基團,容易與質子結合,因此選擇正離子掃描模式。確定丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的母離子Q1分別為m/z 72.0(CH2＝CH－CO－NH3＋)和 75.0(13CH2＝13CH－13CO－NH3＋),丙烯酰胺經碰撞室碰撞后產生的子離子Q3分別為m/z 55.0(CH2＝CHCO＋)和44.0(NH2－CO＋),選擇豐度最強的子離子m/z 55.0為定量離子,m/z 44.0為定性離子。13C3-丙烯酰胺經碰撞室碰撞后產生的子離子分別為m/z 58.0(13CH2＝13CH －13CO＋)和 45.0(NH2－13CO＋),選擇m/z 58.0為定量離子,m/z 45.0為定性離子。進一步優化去簇電壓和碰撞能量,優化后的質譜參數見表1。

2.5 標準曲線和檢出限

移取適量的5.00 mg·L－1丙烯酰胺標準溶液和內標溶液,用水逐級稀釋,配制成丙烯酰胺質量濃度 分 別 為 0.005,0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L－1,內標質量濃度均為0.1 mg·L－1的標準溶液系列,按照儀器工作條件進樣分析。以丙烯酰胺的質量濃度為橫坐標,以丙烯酰胺與內標物的峰面積比值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:丙烯酰胺標準曲線的線性范圍為0.005～1.00 mg·L－1,線性回歸方程為y＝7.429 x＋1.100×10－3,相關系數為0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),計算得檢出限為0.000 3 mg·L－1,測定下限為0.001 mg·L－1。目前國內外未建立餅干中丙烯酰胺的最大殘留限量標準,歐盟規定烘焙咖啡和速溶咖啡中丙烯酰胺的限量值分別為0.40,0.85 mg·kg－1,該方法滿足測定要求。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對市場購買的5種速溶咖啡和5種曲奇餅干樣品進行低(0.05 mg·kg－1)、中(0.10 mg·kg－1)、高(0.50 mg·kg－1)等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定5次,計算回收率和測定值的RSD,結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表3可知,丙烯酰胺在不同種類的速溶咖啡和曲奇餅干中的回收率為88.9%～111%,RSD為2.5%～14%,符合國家標準GB/T 32465－2015《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》的要求[16]。

目前針對咖啡或餅干樣品中丙烯酰胺的測定已有報道,但是缺乏同時測定不同類型基質中丙烯酰胺的方法。本工作參考國家標準和相關文獻,設計了一種2次乙腈提取,2次正己烷除脂的提取凈化方法處理富含極性組分的速溶咖啡和富含油脂組分的曲奇餅干,采用UHPLC-MS/MS同時測定速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺的含量,該方法不需要經過復雜的固相萃取過程,步驟簡單,耗時較短,滿足測定要求。