分子標記技術的優(yōu)缺點及在豬育種上的應用

張云鵬，高 一，張志彬，劉慶雨，張 琪，張樹敏

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春 130124；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林 長春 130124）

1 研究背景及意義

我國常見引進品種為大約克和長白豬的二元雜交品種，具有明顯的繁殖優(yōu)勢，尤其丹系母豬品種產(chǎn)仔數(shù)可達到15～18頭，而肥育豬多為杜長大三元雜交，具有良好的生長優(yōu)勢。我國本地品種的優(yōu)良特性，例如松遼黑豬和新吉林黑豬，多為遺傳性穩(wěn)定、適應能力強、肉質風味獨特等特點[1]，但在繁殖性能和生長速度方面相比國外引進品種有一定的差距。通過常規(guī)的培育方法改變國內(nèi)品種比較緩慢。隨著分子生物技術的發(fā)展，使用候選基因的標記輔助選擇等技術與常規(guī)的育種技術相結合，選擇出有較高繁殖性能的個體，對養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益有較大的意義。豬繁殖性能受許多主效基因的影響，如視黃醇結合蛋白4（RBP4）基因、催乳素受體（PRLR）基因等。標記輔助選擇（Marker-Assisted Selection, MAS）是指利用遺傳標記輔助選擇控制某一性狀的主效基因或數(shù)量性狀位點（QTL），并進一步應用于該性狀的選擇。MAS方法的首要任務是精確定位控制數(shù)量性狀的主效基因或QTL，其中最常用的QTL定位方法之一是候選基因法[2]。因此，從分子遺傳學及生物學方面考慮，尋找與豬繁殖和生長性狀相關的候選基因或遺傳標記，可為今后本地品種繁殖和生長性能改良和尋找有效遺傳標記位點提供參考依據(jù)。

2 分子標記技術

遺傳標記是指可以用來區(qū)分生物個體或群體及其特定基因型的物質標記，并且可以是遺傳穩(wěn)定的。1970年以前，孟德爾創(chuàng)造了形態(tài)學遺傳標記，后又經(jīng)歷了細胞遺傳標記、免疫遺傳標記和生化遺傳標記幾個階段。自1970以來，隨著分子遺傳學的迅速興起，限制性片段長度多態(tài)性、擴增片段長度多態(tài)性、單鏈構象多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性等分子標記技術不斷發(fā)展，成為新一代遺傳標記。分子遺傳標記是以核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，在生物體中生長發(fā)育的不同階段均存在。理想的分子標記相比于傳統(tǒng)的遺傳標記通常具有信息量大、分布廣、穩(wěn)定性強、重現(xiàn)性好、易檢測等優(yōu)勢[2]。

2.1 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）

2.1.1 概念 限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一種利用同源DNA序列變異的技術。用特定的限制性內(nèi)切酶對DNA進行消化后，通過存在不同長度的片段來檢測同源DNA分子的差異。在RFLP分析中，DNA樣品用限制性內(nèi)切酶切成片段，然后用瓊脂糖凝膠電泳按片段長度進行分離[3]。

2.1.2 優(yōu)缺點 與其他基因分型技術相比，RFLP具有一些優(yōu)勢。首先，RFLP位點分布在整個基因組中，標記具有較高的多態(tài)性。不同的限制性內(nèi)切酶也可用于RFLP。其次，RFLP標記是共顯性遺傳，具有高度的重復性。第三，無論環(huán)境影響和基因互作，RFLP所鑒定的多態(tài)位點在不同品種中都能穩(wěn)定地檢測到。由于這些特性，該方法可以同時篩選大量樣品。此外，DNA印跡可以用不同的RFLP探針進行重復分析。缺點是這項技術需要用限制性內(nèi)切酶消化DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)生的片段，用毛細管將片段轉移到膜上，以及用放射性標記的DNA探針進行southern印跡雜交。這些過程非常耗時，涉及昂貴的放射性/毒性試劑，并需要大量高質量的基因組DNA。近年來，這些缺點限制了RFLP的使用。近年來，人們將PCR技術與RFLP技術相結合，即PCR-RFLP，有效地彌補了傳統(tǒng)RFLP技術的諸多不足，大幅簡化了其操作程序[4]。

2.1.3 應用 RFLP是第一種DNA標記分析技術，于1975年首次用于識別腺病毒血清型的溫度敏感突變的DNA序列多態(tài)性。廣泛應用于基因組作圖和變異分析，如基因指紋、構建遺傳圖譜、確定不同性狀的候選基因位置、遺傳疾病診斷和親子鑒定[3]。Short和胡閃耀等[5-6]，利用RFLP-PCR檢測方法分別對4 262頭母豬和633頭美系大白豬、963頭法系大白豬進行研究，發(fā)現(xiàn)雌激素受體基因（ESR）位點多態(tài)性對母豬總產(chǎn)仔數(shù)及產(chǎn)活仔數(shù)等繁殖性狀有顯著影響。

2.2 簡單序列重復（SSR）

2.2.1 概念 簡單序列重復（simple sequence repeat, SSR）標記又稱微衛(wèi)星（microsatellite）DNA，微衛(wèi)星，或簡單序列重復（SSR），基于短（1～6 bp）DNA序列的串聯(lián)重復序列，這些標記由于重復單位數(shù)的變化而高度多態(tài)。利用針對重復序列兩側保守區(qū)的特異引物，可以很容易地檢測特定SSR基因座的重復長度[7]。

2.2.2 優(yōu)缺點 SSR的高度變異性和共顯性、在基因組中的分散性以及自動化的適用性是廣泛應用的主要原因。SSR的主要局限性是在無法獲得現(xiàn)有DNA序列時，分離和鑒定每個基因座所需的時間和成本較高。這一過程需要用SSR特異性探針構建和篩選大小選定的DNA片段的基因組文庫，然后對分離的陽性克隆進行DNA測序，PCR引物合成和檢測。只有這樣才能確定SSR基因座的拷貝數(shù)、信息量和染色體位置。如果取消文庫篩選，并從每個質粒克隆中獲得一個以上SSR位點的序列信息，則可以大幅節(jié)省成本和時間[8]。

2.2.3 應用 SSR技術廣泛用于DNA指紋、親子鑒定、連鎖圖譜構建和群體遺傳學研究的分子標記[7]。利用SSR技術探索微衛(wèi)星DNA在豬個體識別和溯源應用中的可行性，對家畜屠宰后肉制品的跟蹤、追溯具有重要價值。用于我國地方豬品種的遺傳多樣性，為快速、大規(guī)模評估我國地方豬種遺傳資源提供了新的方法[9]。張彩紅利用SSR技術對美系杜洛克豬、法系長白豬等5個品種的胰島素樣生長因子1（IGF-1）基因進行分型并關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)IGF-1基因位點多態(tài)性平均日增重和個體大小有顯著相關[10]。

2.3 擴增片段長度多態(tài)性技術（AFLP）

2.3.1 概念 擴增片段長度多態(tài)性技術（AFLP）是1995年建立的一種高效的基因組指紋技術。AFLP是基于聚合酶鏈反應（PCR）的遺傳多樣性快速篩選標記。整個過程為每個個體生成獨特的DNA指紋。個體間的遺傳差異導致片段的大小和數(shù)量不同。每個DNA片段被稱為一個位點或標記，并以其堿基對大小為特征[11]。

2.3.2 優(yōu)缺點 AFLP方法可以從任何生物的DNA中快速產(chǎn)生數(shù)百個高度可復制的標記，因此，它們可以對指紋質量進行高分辨率的基因分型。由于AFLP每個個體產(chǎn)生大約100個DNA片段，僅根據(jù)長度從凝膠中分離單個感興趣的DNA片段是不可行的。但AFLP的時間和成本效率、可復制性和分辨率均優(yōu)于或等同于其他標記，例如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、微衛(wèi)星（SSR），只是AFLP方法主要產(chǎn)生顯性標記而不是共顯性標記。此外，該方法具有較高的鑒別能力和良好的重現(xiàn)性，能夠在物種和品系水平上進行有效的鑒別。AFLP指紋沒有必要事先了解微生物的基因組序列。此外，AFLP等位基因可以被熒光標記，允許在自動基因組分析儀中對多個樣本進行平行表征[11-12]。

2.3.3 應用 AFLP技術已廣泛應用于多種來源的DNA基因組指紋分析。AFLP是一種有價值的細菌分類技術，在物種和菌株水平上具有高分辨能力和良好的重現(xiàn)性。AFLP標記由于具有高度的可復制性和易用性，已成為一種重要的新型遺傳標記，在系統(tǒng)學、病理分型、群體遺傳學、DNA指紋圖譜和QTL定位等方面有著廣泛的應用[12]。另外可利用AFLP標記計算親本群體間遺傳關系，分析其遺傳距離和豬的主要經(jīng)濟性狀雜種優(yōu)勢的相關性，為豬雜交育種工作進展及地方豬種資源合理開發(fā)、篩選最優(yōu)雜交組合提供了理論依據(jù)[13]。

2.4 單鏈構象多態(tài)性（SSCP）

2.4.1 概念 單鏈構象多態(tài)性（SSCP）是一種可重復、快速和非常簡單的方法，用于檢測聚合酶鏈反應擴增的DNA中的缺失/插入/重排。SSCP依賴的原理是非變性凝膠中單鏈DNA分子的電泳遷移率高度依賴于其大小和結構。在溶液中，由于單鏈核苷酸之間的堿基配對，單鏈DNA分子呈現(xiàn)二級和三級構象。這些構象取決于鏈的長度、序列以及堿基配對區(qū)域的位置和數(shù)量。因此，一級序列中特定核苷酸位置的突變可以改變分子的構象。當在非變性凝膠基質中分離時（溫度為101 ℃），可以分辨出單個核苷酸不同的分子，因為不同的構象導致它們的遷移率發(fā)生變化。SSCP突變檢測率根據(jù)參數(shù)而變化，例如片段的大小、序列的堿基組成、電泳溫度和/或凝膠組成（即孔徑和交聯(lián)）[14]。

2.4.2 優(yōu)缺點 SSCP方法在技術上相對簡單，可以有效直觀顯示擴增產(chǎn)物（100～500 bp）內(nèi)部和之間的不同序列類型，并每天快速篩選數(shù)百個樣品。該技術實用、成本低且省時，還可以通過利用毛細管電泳而不是平板凝膠的電泳來適應高通量形式。但是基于凝膠的小規(guī)模SSCP方案中條帶可以進行切除和測序，并且成本適中，這些比基于熒光的復雜毛細管SSCP系統(tǒng)更具優(yōu)勢。單鏈構象多態(tài)性（SSCP）指紋技術具有一些優(yōu)點：聚合酶鏈反應（PCR）的引物只需要最小的5'端改變；SSCP適用于自動化測序儀中的高通量應用；SSCP凝膠電泳中的第二維度可用于獲得高分辨率的2D凝膠。SSCP凝膠電泳的一個關鍵是嚴格的溫度控制。在不同溫度下運行的凝膠將產(chǎn)生完全不同的指紋。通過在不同溫度下運行同一模板或通過2D-SSCP凝膠電泳，可以利用這一點改進對高度多樣性群落的分析[15-16]。

2.4.3 應用 PCR-SSCP是一種新穎且廣泛應用于基礎和應用生物科學突變檢測的方法。因此，PCR-SSCP被認為是一種最新的方法，不僅可以篩選潛在的序列變異，而且可以識別新的突變。此外，它的速度和簡單的檢測這些類似的突變，使其多應用在臨床診斷實驗室[17]。吳井生利用PCRSSCP和PCR-RFLP技術對楓涇豬、梅山豬和大白豬孕酮受體（PGR）基因進行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)PGR基因突變位點不同基因型總產(chǎn)仔數(shù)及產(chǎn)活仔數(shù)有顯著差異[18]。林筱璐利用PCR-RFLP、PCRSSCP技術對雌激素相關受體α（ESRRα）、鈣調神經(jīng)磷酸酶相關肌小節(jié)蛋白-1（CS-1）基因多態(tài)性與豬肉質性狀關聯(lián)性的研究，ESRRα基因突變位點不同基因型長白豬的肌內(nèi)脂肪含量均差異顯著；而不同基因型杜洛克豬瘦肉率、背膘厚差異顯著，CS-1基因突變位點不同基因型長白豬的瘦肉率、眼肌面積和眼肌厚度有顯著差異[19]。

2.5 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

2.5.1 概念 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是由個體基因組DNA序列之間相同位置的轉換（C/T或G/A）或顛換（C/G，C/A，或T/A，T/G）引起的單核苷酸堿基變異。SNP是遺傳變異的主要DNA多態(tài)性類型，它普遍存在于基因組的基因間隔區(qū)（基因間區(qū)）、基因的編碼序列（外顯子）或基因的非編碼區(qū)（內(nèi)含子、5'非編碼區(qū)、3'非編碼區(qū)或外顯子-內(nèi)含子剪接點）。編碼區(qū)的SNP可分為同義SNP和非同義SNP兩類，后者影響蛋白質序列。編碼區(qū)和調控序列中的單核苷酸多態(tài)性分別對蛋白質功能和基因表達產(chǎn)生重要影響[20]。

2.5.2 優(yōu)缺點 單核苷酸多態(tài)性具有高密度性、成本效益和高通量分析的優(yōu)勢，并易實現(xiàn)自動化，另外還有遺傳穩(wěn)定性好，檢測速度快等優(yōu)點[21]。隨著大量SNP的發(fā)現(xiàn)，而高通量SNP基因分型的需求增加了，其中SNP基因分型技術包括基于凝膠的低通量方法、裂解擴增多態(tài)性序列（CAPS）標記方法、基于PCR的熒光標記高通量方法、高分辨率熔融曲線分析（HRM）、TaqMan探針法熒光定量PCR和競爭性等位基因特異性PCR（KASP）、固定陣列系統(tǒng)分析如Illumina Infinuium、Affymetrix Axiom以及新一代測序（NGS）方法，如限制性內(nèi)切酶的測序基因分型（GBS）[22]。

2.5.3 應用 SNP在遺傳學、育種學、生態(tài)學和進化研究中具有巨大的潛力。在作物遺傳研究中主要用于關聯(lián)作圖和基因組選擇。例如，在植物遺傳學中，單核苷酸多態(tài)性已被廣泛用于基于等位基因特異性分析鑒定物種內(nèi)的順式調控變異，以及發(fā)現(xiàn)與復雜遺傳性狀相關的基因。任麗群[23]利用DNA混池和DNA直接測序的方法對宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬進行研究，發(fā)現(xiàn)催乳素受體（PRLR）基因外顯子10上5個SNP位點，不同基因型對宗地花豬的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)等繁殖性狀均有顯著差異。

3 討論

分子標記技術廣泛用于基因指紋、連鎖圖譜構建、群體遺傳學研究的分子標記、遺傳疾病診斷和親子鑒定。在遺傳學、育種學、生態(tài)學和進化研究中具有巨大的潛力。在出現(xiàn)疫情時，往往帶來的損失是不可必免的，也是慘痛的。而動物個體對疾病的抵抗力通常是治療中的一個關鍵問題，如果通過分子標記技術選育出對疾病有較強抵抗力的個體，可以減少一定的損失。利用SNP基因分型尋找個體對疾病反應的遺傳原因，將對疫情防控上產(chǎn)生深遠的影響。另外，在動物育種方面，通過分子標記技術尋找與豬繁殖及生長相關基因的突變位點，分析其多態(tài)性與繁殖及生長性狀關聯(lián)性，有目的的對群體中具有優(yōu)勢個體進行選育，將對養(yǎng)殖行業(yè)帶來很大的經(jīng)濟效益。基因分型技術正在不斷的創(chuàng)新，這些進步以及數(shù)據(jù)挖掘和分析的強大工具帶來的好處將在許多領域得到認可。