陰道微生態(tài)與HPV感染及宮頸病變相關性的研究進展>

季璇，蔡云朗>

(1.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

研究[1]表明宮頸癌是全球女性第2大惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，2018年我國新增宮頸癌患者約96 000例，占全世界新發(fā)宮頸癌的18%，其中死亡病例大約為26 000例。從癌前病變最后發(fā)展到宮頸癌是一個連續(xù)漫長的過程，持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是其發(fā)生、發(fā)展的生物學病因，宮頸癌患者的HPV感染率高達99.7%[2]，然而，宮頸上皮細胞的病變并不是由HPV單獨感染直接引起的，還需要其他因素的協(xié)同和促進。1889年英國醫(yī)師Stephen Paget提出著名的“種子- 土壤學說”[3]，認為腫瘤的轉移由腫瘤細胞的主動攻擊及“土壤”(靶器官)共同決定。病毒感染也同樣如此，HPV是否定植并且破壞宮頸黏膜，從而一步步演變?yōu)閷m頸癌，不只是由病毒的毒力所決定，陰道微生態(tài)(“土壤”)的平衡狀態(tài)也至關重要。因此，探討陰道微生態(tài)與HPV感染及宮頸病變的相關性和發(fā)展機制，尋找新的臨床預警指標，可以為HPV感染和癌前病變的防治提供新的思路，從而有效降低宮頸癌的發(fā)病率。作者擬針對陰道微生態(tài)與HPV感染及宮頸病變的相關性研究進展作一綜述。

1 HPV特性及其分型

1.1 HPV特性及致病機制

HPV是無包膜的雙鏈DNA病毒，編碼8種主要蛋白質(zhì)，6種位于“早期識別區(qū)域”(E1、E2、E4、E5、E6和E7)，兩種位于“晚期識別區(qū)域”(L1和L2)。E1和E2參與病毒DNA復制和早期轉錄的調(diào)節(jié)；E4有助于病毒從上皮表面逃逸；E5、E6和E7是病毒致癌基因，其表達誘導細胞永生化和轉化。E6和E7是兩種病毒癌蛋白，它們分別使兩種細胞腫瘤抑制蛋白P53和PRb失活，導致細胞周期紊亂，使得細胞逃避機體的免疫監(jiān)視，從而發(fā)展為癌細胞，演變成宮頸癌[4]。

1.2 HPV分型

目前已知的HPV型別有200多種，根據(jù)HPV型別與子宮頸癌發(fā)生的危險性高低分為低危型HPV和高危型HPV。其中高危型中的16、18型與宮頸癌的聯(lián)系最為緊密，此外，在亞洲國家中58、52型引起的宮頸癌所占比例也不容忽視[5- 6]。

2 HPV感染與宮頸病變

早在1983年，有研究人員[7]就利用原位雜交的方法在4例宮頸癌患者的腫瘤細胞基因組中檢測到了HPV- 11相關的DNA片段，首次提出HPV是導致宮頸癌元兇之一的假說，這一假說后來也被多位學者證實。WHO在1995年宣布HPV是導致宮頸癌的首要因素。HPV病毒感染的早期發(fā)現(xiàn)及其與宮頸癌病情進展的關系，也逐漸得到了高度重視。2000年Sellors等[8]研究表明，HPV的感染率隨著宮頸病變級別的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。研究[9]表明，絕大多數(shù)(90%以上)感染的患者可依靠自身免疫力自行清除，少部分(5%～10%)患者因各種原因發(fā)展為持續(xù)感染，從而一步步演變成宮頸癌。

3 陰道微生物群與HPV感染及宮頸病變的關系

3.1 陰道微生物結構

健康女性生殖道內(nèi)寄居著多種微生物，與宿主和周圍環(huán)境相互制約與協(xié)調(diào)，維持著動態(tài)平衡關系[10]。Ravel等[11]使用基于Roche 454 FLX的細菌16S rRNA基因測序，對396個種族不同的育齡婦女的陰道樣本進行了分析，總共確定了282個分類單元，并且通過分層分類學將每個女性的陰道微生物譜分為5種“社區(qū)狀態(tài)類型”(CST)。CST Ⅰ以卷曲乳桿菌為主；CST Ⅱ以加氏乳桿菌為主；CST Ⅲ以惰性乳桿菌為主；CST Ⅳ通常不含乳桿菌屬，而是富含加德納菌屬、普氏菌屬、阿托波氏菌等厭氧菌，陰道pH通常>4.5，被認為與細菌性陰道炎相關[12]；CST Ⅴ以詹氏乳桿菌為主，由較多的厭氧菌組成。

3.2 陰道微生物群與HPV感染的關系

正常情況下，陰道微生物群中以產(chǎn)過氧化氫(H2O2)的乳酸桿菌為優(yōu)勢菌，一方面，乳酸桿菌可通過產(chǎn)生乳酸和H2O2來維持陰道的酸性環(huán)境；另一方面，乳酸桿菌可分泌H2O2、細菌素及其他抗生物因子，從而抑制或殺滅病原微生物，同時通過競爭排斥機制阻止致病微生物黏附于陰道上皮細胞，維持陰道微生態(tài)平衡[13]。若乳酸桿菌豐度下降，不再成為優(yōu)勢菌，其他菌群，如加德納菌、普氏菌屬、纖毛菌屬等厭氧菌屬數(shù)量增多并轉為優(yōu)勢菌群，則陰道微生態(tài)失衡，導致病原微生物入侵。

早在1994年就有學者發(fā)現(xiàn)，HR- HPV感染與陰道微生物群的失調(diào)存有一定的聯(lián)系，陰道乳酸桿菌減少、厭氧菌過度生長，會增加高危型HPV的表達[14]。近年來，有越來越多的國內(nèi)外學者在這方面進行了更深層次的研究。Lee等[15]首次利用高通量測序方法對韓國雙胞胎女性HPV感染對陰道微生物群組的影響進行了橫斷面的研究，觀察到HPV陽性的女性陰道微生物群更具多樣性，而乳酸桿菌屬則明顯減少。此外，他們確定了纖毛菌屬為HPV感染的標志性微生物，且在9對單卵雙生的雙胞胎中，HPV陽性者惰性乳桿菌比例較未感染HPV的雙胞胎姐妹有明顯的下降(P=0.03)。Brotman等[16]對北美32名性活躍的絕經(jīng)前婦女進行了歷時16周的縱向研究，在共計930個陰道樣本中觀察到CST類型與HPV的感染及持續(xù)時間顯著相關(P=0.008)，CST Ⅲ、Ⅳ的女性HPV陽性率更高，分別為71%和72%，以加氏乳桿菌為主導的CST Ⅱ可能與急性HPV感染的最快速清除有關，提出加氏乳桿菌是維持宮頸健康的潛在治療物種。古萍[17]等對128名女性進行隨機對照研究，發(fā)現(xiàn)HPV陽性者陰道乳酸桿菌計數(shù)及乳酸桿菌所占陰道細菌比例較HPV陰性者低,并且隨著乳酸桿菌數(shù)量的增多HPV- DNA載量逐漸減少，且兩組陰道惰性乳桿菌、加氏乳桿菌、卷曲乳桿菌數(shù)量比較差異均有統(tǒng)計學意義。康玲[18]等通過探討高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變 (HSIL) 錐切手術前后陰道菌群構成的差異發(fā)現(xiàn)，HPV陽性患者術后HPV轉陰后陰道菌群出現(xiàn)了向常見陰道優(yōu)勢菌屬轉變的趨勢，由原來的惰性乳桿菌轉變?yōu)橐跃砬闂U菌為優(yōu)勢菌。駱菲等[19]通過分析39例高危型HPV感染患者的陰道菌群發(fā)現(xiàn),加德納菌屬在HPV感染組低級別鱗狀上皮內(nèi)病變 (LSIL) 型患者中為優(yōu)勢菌, 乳桿菌屬為HPV陰性者優(yōu)勢菌。提出高危型HPV感染者陰道菌群多樣性增加，乳酸桿菌豐度下降，加德納菌屬為LSIL與HPV陰性女性的差異菌, 乳桿菌屬為HPV陰性女性陰道特征菌。總之，結合國內(nèi)外多項研究，可得出HPV陽性者陰道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量明顯下降，除乳桿菌屬之外的其他微生物群種類及數(shù)量增多。

3.3 陰道微生物群與宮頸病變嚴重程度的關系

繼研究發(fā)現(xiàn)陰道微生物群與HPV感染的關系后，研究者也陸續(xù)對不同程度的宮頸病變患者的陰道微生物群結構進行了研究。Mitra等[20]對英國的169名婦女進行了研究(20名正常對照，52例LSIL，92例HSIL和5例浸潤性宮頸癌)，結果顯示隨著宮頸病變程度的加重，陰道微生物群的多樣性增加，而乳酸桿菌的相對豐度降低，隨著疾病嚴重程度的增加，CST Ⅳ的患病率也逐步增加，LSIL、HSIL和浸潤性宮頸癌的CST Ⅳ患病率分別高出2、3、4倍。此外，與LSIL相比，HSIL患者的纖毛菌屬、厭氧球菌和消化鏈球菌等明顯增多，而詹氏乳桿菌減少。隨后有研究人員[21]對墨西哥的32名婦女(20例正常對照、4例宮頸上皮內(nèi)瘤變和8例宮頸癌)的陰道微生物群和陰道黏膜細胞因子進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著病變嚴重程度的增加纖毛菌屬和梭狀桿菌的數(shù)量相對增多，且梭狀桿菌數(shù)量的增加與IL- 4和TGF- 1βmRNA的表達水平增高有關，認為可能是梭狀桿菌抑制陰道局部免疫應答，促進HPV免疫逃逸和宮頸病變的發(fā)展。然而這兩項研究均為觀察性研究，缺乏縱向研究數(shù)據(jù)，因此只能證明與疾病狀態(tài)相關，而不能確定因果關系。盡管多項研究已表明某些陰道微生物群可能會增加暫時性和持續(xù)性HPV感染的機會，但仍需要更多的工作來研究宿主、微生物群、病毒感染與癌變之間的復雜關系，為穩(wěn)定陰道微生物群結構的治療策略挖掘潛力，使之能夠有效抵御病原微生物的入侵，這將有更深遠的臨床意義。

3.4 陰道微生物群介導的HPV感染的潛在機制

目前尚缺乏明確的相關機制的研究，可能的機制有：(1) 陰道乳酸桿菌通過分解陰道黏膜上皮內(nèi)的糖原產(chǎn)生乳酸，降低陰道pH值，陰道的酸性環(huán)境可抑制HPV的感染；(2) 乳酸桿菌可產(chǎn)生H2O2促使蛋白抑制劑與其結合，抑制HPV的復制；(3) 陰道乳酸桿菌可生產(chǎn)細菌素等抑制物，來預防細菌性陰道病相關細菌的定植，從而維護宮頸上皮屏障功能，有效抑制HPV進入基底角質(zhì)形成細胞；(4) 當與BV相關的厭氧菌定植時，這些細菌會產(chǎn)生酶和代謝產(chǎn)物，這可能會破壞宮頸上皮屏障，從而促進HPV進入。同時，陰道微生物群還可以通過作用于幾種細胞途徑，從而影響宮頸局部免疫系統(tǒng)，導致HPV持續(xù)感染以及宮頸病變進展[17,22- 23]。

4 陰道局部免疫系統(tǒng)與HPV感染的關系

4.1 HPV感染后的免疫應答

研究[24]表明，大部分女性能夠通過自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)測和防御來自行清除HPV，避免HPV的持續(xù)性感染。人體免疫系統(tǒng)通常分為固有免疫和適應性免疫兩種類型:固有免疫在HPV感染早期發(fā)揮非特異性作用；適應性免疫應答為機體防御HPV的第2道防線，可特異性識別HPV，防止HPV的再感染。固有免疫與適應性免疫相互協(xié)調(diào)，共同作用，HPV的防御和有效清除與機體正常的免疫功能密不可分。因此，若陰道局部免疫屏障受到破壞，則會增加HPV的易感性和持續(xù)感染率。

4.2 陰道局部固有免疫與HPV感染及宮頸病變的相關性

當病原微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時，固有免疫可通過Toll樣受體識別病原微生物，從而激活樹突狀細胞(DCs)或巨噬細胞，并且可同時調(diào)節(jié)固有免疫和適應性免疫[25]。DCs是目前發(fā)現(xiàn)的抗原提呈功能最強的抗原提呈細胞，而DCs中尤其以朗格漢斯細胞(LC)的抗原提呈能力最為突出。江大瓊[26]等研究發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變程度加重LC數(shù)量逐漸增多，LC數(shù)量HPV16陽性組比陰性組少(P=0.011)，提示當感染HPV16后局部的LC數(shù)量將會減少，這將會限制啟動免疫應答，加重HPV16感染甚至發(fā)生持續(xù)感染。巨噬細胞功能弱于DCs，可分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞主要分泌IL- 1、IL- 6、IFN- γ、TNF- α等細胞因子殺傷宿主細胞。自然殺傷細胞也對抵抗HPV感染起著重要作用，可分為非多樣性自然殺傷T細胞(iNKT)與多樣性自然殺傷T細胞(nNKT)。CD1d作為非典型的MHC- Ⅰ類分子可以將抗原遞呈給iNKT，促使其分泌多種細胞因子，包括IFN- γ、IL- 4、IL- 10等，以抵抗病毒感染。Hu等[27]研究表明，在HPV陽性宮頸組織中觀察到iNKT顯著增加，尤其是在CINⅡ- Ⅲ中，并且隨著宮頸病變程度加重HPV陽性宮頸組織中的IFN- γ表達也增加，認為從HPV感染到發(fā)展為CIN的過程中，宮頸組織中iNKT的聚集表明其可能在抑制免疫中起重要作用，IFN- γ表達可能與HPV感染狀態(tài)有關。

4.3 陰道局部適應性免疫與HPV感染及宮頸病變的相關性

T細胞介導的細胞免疫是抗HPV感染最重要的一種免疫應答方式。研究[28- 29]表明，在高危型HPV感染合并或不合并宮頸病變的患者中，CD4+/CD8+T細胞的值均表現(xiàn)為降低，可以自行緩解的CINⅠ患者CD4+T細胞的表達及CD4+/CD8+T細胞的值均顯著高于進展的CINⅡ和CINⅢ的患者，CD4+/CD8+T淋巴細胞<1的宮頸癌患者HPV陽性率遠高于比值≥1的患者。

在發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞亞群的失調(diào)與HPV感染及宮頸病變關系的基礎上，也有越來越多的國內(nèi)外學者從宮頸局部的細胞因子表達水平的層面進行了研究，有研究對宮頸局部T細胞亞群和炎癥因子改變對HPV感染的影響進行了分析，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的加重，宮頸局部CD4+/CD8+T細胞及Th1/Th2細胞的值均逐漸降低；IFN- γ、IL- 2的含量與HPV感染呈負相關，乳酸桿菌的陰性率、IL- 4的含量與HPV感染呈正相關，且IFN- γ、IL- 2的減少及IL- 4的增多都是HPV感染的獨立危險因素[30]。Li等[31]對117例持續(xù)高危型HPV感染女性(43例慢性宮頸炎、35例LSIL、39例HSIL)的宮頸細胞因子(包括IL- 2、IL- 4、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、TNF、IFN- γ)的表達水平進行了研究，并根據(jù)IL- 2和IL- 6的表達水平進行細胞因子評分，結果顯示疾病嚴重程度與IL- 6水平呈正相關，與IL- 2水平呈負相關。高細胞因子評分的HPV陽性患者3年內(nèi)發(fā)生HSIL的風險增加，風險比為3.12。其中通過對HSIL組的細胞因子評分和TCT檢查結果的比較發(fā)現(xiàn)，細胞因子評分的診斷敏感性、特異性、Youden指數(shù)以及陽性和陰性預測值均優(yōu)于TCT。王小花等[32]研究也發(fā)現(xiàn)，HPV陽性者Th17細胞、IL- 17、IL- 6、IL- 4和TGF- β的表達水平均明顯高于HPV陰性者。Winkle等[33]利用人類3- D陰道或?qū)m頸組織來探索IL- 36γ在宿主抵御人類女性生殖道病原體中的可能作用，將陰道或?qū)m頸上皮細胞暴露于病毒或細菌，并測定IL- 36γ及其受體的誘導和調(diào)控，結果發(fā)現(xiàn)IL- 36γ可通過增加基因表達使自身及其受體自我擴增，并促進其他炎癥信號通路來刺激免疫應答，防止病原微生物的入侵和定植。這也是首次證明女性陰道上皮細胞中存在IL- 36γ及其受體并在此被病原微生物誘導分化的報道，證明IL- 36γ是微生物入侵上皮細胞后免疫激活的驅(qū)動因素，在女性生殖道的宿主防御中發(fā)揮著關鍵作用。IL- 36γ是一種新的促炎因子，屬于IL- 1細胞因子家族，呂全省等[34]研究發(fā)現(xiàn)，IL- 36γ可以與IL- 12協(xié)同刺激CD8+T淋巴細胞的作用，增強其細胞因子分泌功能。此外，IL- 36γ可以作為免疫佐劑以誘導增強病毒特異性的CD4+T和CD8+T細胞應答，并可促進TNF和INF- γ的產(chǎn)生。但目前關于IL- 36γ與HPV感染及宮頸病變程度的相關性的研究尚且不多，還需臨床進一步驗證。

5 總結與展望

HPV感染是有過性生活的女性常見的一種病毒感染，但有90%以上的健康女性可自行清除病毒，陰道微生態(tài)的平衡是機體抵御HPV感染和定植的關鍵環(huán)節(jié)，陰道微生態(tài)的改變主要包括陰道內(nèi)微生物群的改變、陰道局部免疫屏障的破壞等，一方面微生態(tài)平衡被打破，可導致HPV趁機入侵上皮細胞，造成HPV感染；另一方面可促進HPV的持續(xù)感染和宮頸病變的發(fā)生。與此同時，HPV的感染也會導致陰道微生態(tài)紊亂，兩者互為因果，相互影響。因此，維持陰道微生態(tài)的平衡有助于防止HPV感染及宮頸病變的發(fā)生，探討陰道微生態(tài)與宮頸HPV感染及宮頸病變的相關性和發(fā)展機制，尋找新的臨床預警指標，對指導臨床治療HPV感染及宮頸病變至關重要，從根本上預防宮頸癌的發(fā)生。