線粒體自噬在蛛網膜下腔出血中的研究進展

張永智，劉彬冰，田楊，史懷璋

線粒體自噬為一種保守的、線粒體特異性的自噬清除過程[1]。作為一種選擇性的受損線粒體清除過程，其對于線粒體穩(wěn)態(tài)及細胞存活的維持至關重要[2]。蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h內的早期腦損傷（early brain injury，EBI）階段，包括顱內壓增高、灌注壓減低、血腦屏障破壞、腦水腫及氧化應激等病變，以及遲發(fā)性腦血管痙攣階段導致的腦缺血等病變均可以導致神經元能量供應異常、線粒體腫脹，繼而釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）及細胞色素C（cytochrome C，CytC）等物質進入細胞質，引起神經元的凋亡及壞死[3-5]。因此，作為維持線粒體穩(wěn)態(tài)及清除受損線粒體的手段，線粒體自噬功能對于健康的維持及疾病的治療至關重要。且腦神經元復雜的功能決定其需要更多的線粒體來提供能量，同時由于神經元為高度分化細胞，不能通過細胞分裂的方式清除細胞內的異常蛋白及受損細胞器，更增加了其對于線粒體活性及功能穩(wěn)態(tài)的依賴[2，6]。所以在發(fā)生SAH的早期，如果適當誘導啟動線粒體自噬、避免神經元死亡，將可能改善SAH患者的預后[1]。因此本文對線粒體自噬機制，SAH后線粒體形態(tài)變化對預后的影響，以及線粒體自噬在SAH中作用機制的研究進展進行了綜述。

1 線粒體自噬

目前經典的線粒體自噬通路主要分為：①PINK1-Parkin介導的泛素依賴途徑；②不依賴泛素的線粒體受體蛋白介導的線粒體自噬。

1.1 PINK1-Parkin介導的泛素依賴途徑的線粒體自噬 在外界應激刺激下，線粒體膜電位減低，PINK1蛋白被持續(xù)轉運至線粒體內膜的過程受阻，使得PINK1停留在線粒體外膜[7]。隨后PINK1通過自身磷酸化的方式激活[8]，使得Parkin蛋白轉位至線粒體外膜表面。Parkin為E3泛素連接酶，被PINK1磷酸化激活后可發(fā)揮正反饋機制，泛素化多種線粒體外膜蛋白，產生PINK1的底物——多聚泛素蛋白鏈。隨著視神經誘變蛋白（optineurin，OPTN）和核點蛋白52（nuclear dot protein 52，NDP52）等多種蛋白聚集至受損線粒體外膜。OPTN、NDP52等誘導受損線粒體與自噬體膜蛋白-微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，LC3）結合，激活了線粒體自噬[9]。在SAH大鼠模型中已證實了PINK1/Parkin的參與[10-11]，且動物實驗證明PINK1/Parkin途徑在腦組織中最活躍，內源性Parkin可減少中腦多巴胺能神經元的丟失[12]。研究表明在神經元中，去泛素化酶USP30具有對抗線粒體自噬的作用[13]，其通過抑制Parkin底物活性發(fā)揮作用，同時研究者還發(fā)現USP30缺乏可以減輕多巴胺神經元的氧化應激損傷。更值得注意的是，Wauer等[14]發(fā)現PINK1介導的泛素鏈磷酸化可以保護已被磷酸化的泛素鏈不受去泛素化酶的降解，從而放大線粒體自噬信號通路。

1.2 不依賴泛素的線粒體受體蛋白介導的線粒體自噬 線粒體受體蛋白參與線粒體自噬的一般特性為不依賴泛素化[1，15]，其與自噬體結合，靶向清除受損的線粒體。受體蛋白主要與LC3及A型γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受體相關蛋白（GABA type A receptor-associated protein，GABARAP）的LC3相互作用區(qū)（LC3-interacting region，LIR）模體（motif）相結合，介導受損線粒體的清除[16]。參與線粒體自噬的線粒體受體蛋白主要包括NIP3樣蛋白X（NIP3-liked protein X，NIX）、BCL-2相互作用蛋白3（BCL-2 interacting protein 3，BNIP3）及FUN14家族蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1，FUNDC1）。NIX和BNIP3都擁有高度保守的LIR模體，在不同的應激刺激下，通過與LC3及GABARAP蛋白結合，參與線粒體自噬[17]。LIR模體的磷酸化，促進了NIX與LC3結合，介導線粒體清除。而BNIP3則通過釋放視神經萎縮蛋白1（optic atrophy 1，OPA1），招募線粒體動力相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1），干擾線粒體動力，促進受損線粒體的分裂，進而加速了線粒體的清除[18-19]。

少數線粒體受體蛋白也同時參與了Parkin途徑的線粒體自噬，如分布于線粒體內膜的抗增殖蛋白（prohibitins，PHBs）及心磷脂，在能量供應障礙引起的應激狀態(tài)下，PHB2參與了Parkin途徑的線粒體清除[20]。線粒體膜電位去極化、蛋白酶活性增加，使得線粒體外膜受損破裂，PHB2暴露于細胞質中，隨后與LC3及自噬標志蛋白p62結合形成復合體。該復合體在受損線粒體處調節(jié)自噬體的產生，從而促進受損線粒體的清除[21]。但是在SAH后早期PHB2下降，說明SAH誘導線粒體自噬啟動不夠充分，當神經元遭受如氧化應激等嚴重損傷時，線粒體自噬作用不足以對抗損傷，最終神經元將不可避免地進入細胞死亡過程[10]。

2 線粒體形態(tài)與蛛網膜下腔出血

作為細胞內的高度動態(tài)化細胞器，線粒體通過融合（fusion）和分裂（fission）過程調節(jié)自身形態(tài)及能量產生，以適應細胞內外各種應激及能量供應異常等刺激。其中高度極化的神經元長樹突和軸突的延伸特征對線粒體動力學更是提出了挑戰(zhàn)：如何在一個神經元內有效地傳輸線粒體以能為遠近端提供能量并調節(jié)其Ca2+水平[22]。線粒體在融合過程中，主要由線粒體融合蛋白1（mitofusion 1，MFN1）及2（MFN2）介導線粒體外膜的融合，而OPA1介導線粒體內膜的融合[22]。而線粒體分裂，作為線粒體自我更新及清除的手段，同時也是線粒體自噬中不可缺少的一步，主要由Drp1介導線粒體內膜和外膜的分裂[2，22]。Wu等[23]在SAH大鼠中應用Drp1蛋白的選擇性抑制劑Mdivi-1，發(fā)現其可以減輕線粒體的過度分裂和線粒體嵴斷裂，繼而減輕細胞凋亡、氧化應激等損傷，改善SAH大鼠預后。

線粒體形態(tài)和線粒體自噬之間的關系體現在，如同線粒體膜電位減低一樣，線粒體形態(tài)學改變將成為線粒體自噬的激活/抑制信號，將細胞狀態(tài)與線粒體功能連接起來[22]。而線粒體融合與分裂二者之間并非是割裂對立的，目前研究發(fā)現，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）對Drp1及MFN2均有磷酸化激活作用[24-25]。作為細胞內能量感受器，AMPK被激活后，可以直接磷酸化激活unc-51樣自噬活化激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1），或抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性間接激活ULK1參與線粒體自噬[26-28]。Li等[29]在SAH大鼠及細胞內應用mTOR的抑制劑雷帕霉素，發(fā)現其可以減少Drp1活性形式的過度表達，減少線粒體的過度分裂，從而改善預后。Wu等[30]也發(fā)現Honokiol（和厚樸酚，一種去乙酰化酶Sirtuin-3的激動劑）可以通過AMPK依賴的方式，促進MFN1和MFN2的表達，促進線粒體融合，減輕SAH后早期腦損傷。

3 激活/抑制線粒體自噬對蛛網膜下腔出血的影響

在SAH后的早期，線粒體自噬通過清除受損線粒體而避免神經元的進一步死亡。但是當受損線粒體的數量過多、程度過重時，將超過線粒體自噬清除受損線粒體的能力，此時細胞凋亡及壞死將占據主導，同時伴隨著自噬途徑的關鍵蛋白失活，最終導致細胞死亡[31]。Zhang等[10]研究發(fā)現，在大鼠發(fā)生SAH后的早期，線粒體自噬及凋亡水平都出現了增高。根據線粒體產生ATP及ROS的多少，細胞內的變化可能不同：當ATP數量較多時，以線粒體自噬為主；當ATP缺乏、Ca2+增多及ROS產生時，將主要導致細胞的凋亡及壞死[32]。在SAH大鼠中應用線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或褪黑素后，線粒體自噬相關蛋白表達明顯增多、凋亡減低，減少了退化神經元產生的同時，還改善了SAH大鼠短期及長期的神經功能預后[10-11]。反之，將參與線粒體自噬蛋白的抑制劑應用于SAH大鼠，將降低線粒體自噬通路相關基因的表達，導致線粒體自噬水平減低，神經元凋亡及壞死水平升高，血腦屏障通透性增加，SAH大鼠的腦水腫程度及神經功能障礙加重[10，33]。

在缺血性腦疾病研究中，認為在腦缺血的初始階段以及在永久性腦缺血模型中，過度的自噬可誘導細胞死亡加重損傷，此時的自噬抑制劑具有神經保護作用[34-36]。而在目前的SAH研究中尚無此發(fā)現，一些學者認為與缺血性卒中的缺血再灌注損傷階段一致，提高線粒體自噬水平將對神經元提供保護作用[37-38]。Palikaras等[1]認為最理想的治療策略是同時激活線粒體自噬和生物合成，以減少線粒體數量的丟失及細胞死亡。

電壓依賴陰離子通道蛋白1（voltagedependent anion channel 1，VDAC1）為線粒體外膜通道蛋白，介導Ca2+進出線粒體[39]。Li等[33]在SAH大鼠中發(fā)現VDAC1參與了線粒體自噬，VDAC1的表達在SAH后24～48 h到達頂峰，并誘導LC3 Ⅱ（LC3的活性形式）增多。與LC3的共定位、TUNEL染色、PI染色均證實VDAC1誘導的線粒體自噬在抑制細胞凋亡及壞死中發(fā)揮了作用。

總之，線粒體自噬作為神經元應對外界各種應激刺激下自我存活的一種應激保護性反應，在SAH發(fā)生后具有神經元保護作用。本文主要介紹了線粒體自噬的經典通路、在SAH中的作用機制及其對預后的影響。雖然目前仍未出現可以轉化應用于臨床SAH的線粒體自噬激活藥物，但目前已經在臨床上應用的部分藥物（如二甲雙胍等）已被證明對線粒體自噬具有調節(jié)作用。因此，在未來的SAH研究中，除了繼續(xù)探索SAH中的線粒體自噬，更要嘗試將其向臨床轉化，探尋促進線粒體自噬的藥物，進而改善SAH患者的預后。

【點睛】本文介紹了線粒體自噬依賴/不依賴泛素的兩種經典通路；線粒體形態(tài)改變（通過融合/分裂）可激活/抑制線粒體自噬從而調控細胞的存活或死亡；在SAH中通過促進線粒體自噬可改善患者預后。