抗體介導骨再生的研究進展

楊 瑤，陳方淳,3*

（1.重慶醫科大學附屬口腔醫院，重慶，401120；2.口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室，重慶，401120；3.重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶，401120）

創傷、骨腫瘤切除、骨髓炎手術清創等多種原因造成的骨缺損仍然是臨床醫生所面臨的一大難題。傳統的自體骨和異體骨移植占每年骨移植的90%以上[1,2]。但是，骨移植有許多缺點，如供體有限、供體部位的發病率高（如感染、疼痛、出血和神經損傷）及成本較高[3]。骨組織工程旨在協調生物材料支架、細胞和分子信號的生物學優勢，以介導骨再生。目前，骨組織工程有多種形式，包括基因治療，干細胞治療及蛋白質治療。其中蛋白質治療，使用生長因子或細胞因子，包括靶向運輸和載體持續釋放治療蛋白。外源性骨誘導生長因子包括轉化生長因子-β、血管生長因子等，他們具有良好的生物相容性，已被用于骨組織工程[4,5]。其中TGF-β超家族中的骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）在骨愈合中的作用已經被廣泛研究，其中內源性BMP2在骨再生的初始級聯中起著至關重要的作用[4]。有在2002年重組人骨形態發生蛋白-2 (recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP-2)和rhBMP-7已被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準用于脊柱融合等骨相關疾病的治療[6]。rhBMP2不僅被證明可以促進新骨形成，招募骨母細胞，而且還可以促進血管生成[7]。然而，rhBMP2使用的過程中也有一些自身局限，如使用量需超出生理劑量，在體內半衰期短、生物活性低等不足[8]。且近年來隨著臨床使用增多，rhBMP2的并發癥報道迅速增多，發生率約為20-70%，主要包括嚴重水腫、骨塌陷、愈合不良、異位成骨等，嚴重者可致生命威脅[9]。

理想的骨再生法可以加速和擴大宿主的再生反應，但不會引起有害的副作用。對于研究者來說使用一種可以全身或者局部遞送治療藥物然后激活或者結合體內內源性因子尤其是骨形態發生蛋白的骨再生方法是值得深入探索的一項研究。

免疫球蛋白G（IgG）是體液免疫的主要構成要素，具有結構保守的N-糖基化Fc端，以及兩個具有特異性抗原識別能力的Fab端，包括四型（IgG1，IgG2，IgG3及IgG4），其中IgG1與IgG2為主要應用類型[10]。傳統的IgG抗體治療主要利用Fab端中和靶向抗原的作用，目前超過20多種單克隆抗體已成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病與感染性疾病等[11]。但是抗體在骨再生方面的研究較少，所以本篇文章主要是總結抗體介導的骨再生的研究現狀。

1 抗體介導骨再生的概念

在2011年Freire等人針對重組人骨形態發生蛋白2（rhBMP2）的不良免疫反應以及超生理劑量等問題提出了抗體介導的骨再生技術，顯示了在動物模型中利用抗體捕捉內源性骨形態發生蛋白可促進骨形成的可能性[12]。首先，他們提出假設為能夠參加AMOR的抗體分子必須具有下列特性:1.對內源性BMP-2有較高親和力；2.BMP-2抗原表位能與BMP-2受體結合區域的遠程；3.Ab-BMP2免疫復合物能夠與骨祖細胞細胞表面的BMP2受體結合；4.Ab-BMP-2免疫復合物能夠介導細胞內信號傳導；5.Ab-BMP2免疫復合物對成骨分化有調節作用；6.抗體在宿主中不存在有害的局部或全身免疫反應。針對以上假設，體外實驗結果顯示：并不是所有的抗體形成免疫復合物后能夠與細胞表面的受體結合及進一步促進骨形成；體內實驗顯示：與對照組相比，只有鼠源性單克隆抗體4B12和3G7可以顯著增加顱頂骨缺損模型中的骨密度。此外，單克隆抗體（mAb）組顯示形成骨量比多克隆抗體（pAb）組多17-24%，猜測這可能是由于pAb和mAb之間的免疫特性差異造成的，因為多克隆抗體會與許多表位反應，其中一些表位可能阻斷了內源性BMP-2與其細胞受體之間的結合從而抑制了成骨。之后研究人員使用嵌合型單克隆抗體克服鼠源性單抗可能帶來的潛在不良免疫反應，在大鼠顱頂骨缺損模型第6周時評估了骨充填率，鼠源性單克隆抗體組的骨充填率為7%-42%[12]，嵌合單克隆抗體為8%-46%[13]，兩者成骨能力無明顯顯著差異，這可能是與鼠和人的BMP2基因有顯著的同源性有關（92.2%）[14]。因此決定AMOR潛力的抗體的關鍵特征在很大程度上是未知的。此外其他研究進一步顯示，抗體不僅能夠將內源性BMP2招募到骨缺損區域并與之結合，還能與內源性BMP4和BMP7結合進一步增強內源性信號和促進成骨促進骨再生的能力[15]。2014年，Ansari等人評估了大鼠顱頂骨缺損局部應用1ug/ml至100ug/ml的不同劑量的單克隆抗體的成骨效能，根據組織形態學和顯微CT檢查結果顯示了25ug/ml的濃度可以形成最大骨量，同時在抗體植入的部位發現大量的細胞浸潤。且該研究在體外進一步探索了Ab-BMP2免疫復合物與C2C12細胞（成肌細胞）結合后細胞內的信號通路，結果顯示Ab-BMP2免疫復合物組細胞高表達Runx2和p-Smad1，而抑制成骨細胞分化的因子Smad6的表達無明顯改變[16]。因此猜測Ab-BMP2免疫復合物通過經典的Smad信號通路促進骨生成。Qingqing Wu等人進一步體外研究證明：Ab-BMP2免疫復合物與干細胞表面的BMP2受體結合后，啟動細胞內BMP2/Smad/Runx2信號通路誘導細胞成骨分化[17]。但是免疫復合物具體的作用方式及通路還需進一步探索。目前，對于rhBMP2及抗體介導的骨再生所形成的骨質還有一些爭議。在Ansari[16]、Freire[13]及Moshaverinia[18]等人的研究中rhBMP2和Ab-BMP2免疫復合物組及rhBMP2和抗BMP2抗體組沒有觀察到骨礦化的差異。但是在有的研究中發現植入rhBMP2組的顱骨缺損部位表現出異常的組織學形態，伴有營養不良型性鈣化[8]。無論如何，根據所有這些事實，可以得出結論，局部應用抗體促進骨愈合的能力與rhBMP2相當且可能要優于rhBMP2。

1.1 抗體糖基化改性

有研究表明抗體的糖基化修飾可能會改變抗體結合抗原的能力及Fc端介導的效應，同時糖基化的靶向修飾已經成為生產免疫治療藥物的重要部分。Qingqing Wu等人改變了抗BMP2抗體的唾液酸化，以研究糖基化對抗體介導的骨髓間充質干細胞成骨分化的影響[19]。體外研究顯示：Ab-BMP2免疫復合物能通過結合BMP2受體在體外刺激骨髓間充質干細胞的成骨分化，但誘導潛能不受體外唾液酸化程度的顯著影響。但是在體內發現：過度唾液酸化的Ab-BMP2免疫復合物介導成骨的能力增強，而去唾液酸化組的成骨能力受到抑制。唾液酸化對BMP2-ICs成骨潛能的影響在體內和體外研究中是不一致的，這些相互矛盾的結果表明Ab-BMP2免疫復合物中的BMP2不是決定免疫復合物在體內成骨潛能的唯一部分。這些問題需要進一步研究。

2 抗體介導的骨再生研究模型

上述研究都是是采用大鼠顱頂骨缺損模型，后續有用較大型的兔子的顱骨缺損模型[13]，及犬及非人靈長類動物下頜骨節段連續性缺損模型及脛骨不連續缺損模型進行實驗[20,21,22]。在犬的下頜骨節段連續性缺損模型觀察12周后，與rhBMP2組相比，單克隆抗體組形成的骨密度更高且人的正常骨密度相當。同樣在獼猴的下頜骨及脛骨缺損模型中，也有相似的實驗結果。之前的體內研究都是采用原位成骨模型，而在Qingqing Wu等人的研究中采用了異位成骨模型，即在小鼠皮下注射包含抗體及細胞的藻酸鹽微球[17]。與原位成骨模型相比，皮下植入的皮內環境減少了內源性骨形成細胞、骨刺激細胞因子、機械轉導及其他相關因素的影響。藻酸鹽微球被用作載體來傳遞和固定細胞，Abs或rhBMP2。微球不具有任何骨誘導功能。因此，異位成骨模型在理論上確保了新形成的骨是由于植入的誘導多能干細胞來源的間充質干細胞（iPSC-derived mesenchymal stromal cells,iMSC）（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）、抗BMP2單克隆抗體、rhBMP2或它們的組合效應的成骨潛能。體內研究顯示：抗體的促骨再生效果優于直接使用rhBMP2，表現為在rhBMP2誘導下局部形成營養不良性鈣化，而抗體組所誘導的新生骨則具有生理性板層狀骨小梁結構，TRAP染色抗體組陽性細胞增多，猜測這可能與抗體植入局部出現了支持骨改建的破骨細胞相關。

在所有采用局部使用抗體的動物研究中，未報告任何種類的不良免疫反應，包括血清病、急性過敏反應和細胞因子釋放綜合征及局部皮膚反應。低濃度局部使用的治療性單克隆抗體的不良發生率相對較低且安全性較高。在人類臨床試驗開始之前，需要更嚴格的毒理學研究及深入研究。

3 抗體介導的骨再生的支架

不同的骨缺損可能需要不同的物理性質的支架材料，其中鈦、生物陶瓷，羥基磷灰石和可吸收明膠海綿三者各有優勢；ACS和藻酸鹽具有很高的生物相容性和生物降解性，適用于不需要抗壓強度的骨內缺損[18]；而Ti及生物陶瓷因其具有較強的剛性，適用于在整形外科和頜骨的骨缺損[23]。

Moshaverinia 等人展示了一種骨髓間充質干細胞和抗體的共囊技術結合到RGD偶聯藻酸鹽水凝膠體系[18]。他們的研究再次證實了抗原抗體復合物和干細胞上的BMP2受體之間的交叉連接，且體內骨量增加明顯。而Qingqing Wu等人則通過采用包含iMSCs和抗體的藻酸鹽微球體系，結果發現小鼠皮下植入iMSCs +3G7組的位點顯示出顯著的骨形成和血管形成，且該組的實驗效果優于3G7組[17]。因此干細胞和生物分子的同時應用可以為組織工程提供一個改善骨缺損愈合的微環境。

4 總結

對于臨床醫生，骨缺損的重建是最具挑戰性的問題之一。在這方面，尋找新的方法來克服傳統方法的一些缺點對研究人員來說是十分必要的。該文章表明，局部應用抗體將內源性生物活性分子吸引到缺陷部位進一步促進骨再生的方法具有可行性，但是如果將其用于臨床需要更多方位的研究。