PPR蛋白在植物細胞器組分轉錄后調控中的作用機制

郝媛媛，趙向前，黃福燈，李春壽

綜 述

PPR蛋白在植物細胞器組分轉錄后調控中的作用機制

郝媛媛，趙向前，黃福燈，李春壽

浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所，杭州 310021

PPR (pentatricopeptide repeats)蛋白是陸生植物中最大的蛋白家族之一，是一類RNA結合蛋白，參與細胞器基因的轉錄后加工過程，對細胞器的生物合成和功能具有深遠影響。PPR突變后造成葉綠體光合電子傳遞鏈和線粒體呼吸鏈等進程受損，最終通過影響光合作用或者呼吸作用，造成植株生長發育異常，影響產量、育性、籽粒品質等。近年來，關于該蛋白家族成員參與植物生長發育的報道越來越多，但由于該家族龐大，大部分成員的功能還未被解析。本文系統總結了目前PPR蛋白調控細胞器基因轉錄后加工的分子機理及對細胞器和植株發育的影響，提出PPR家族還未解決的問題，為深入解析該基因家族的功能及育種應用提供理論基礎。

PPR蛋白；轉錄后調控；細胞器代謝；植株生長發育

PPR (pentatricopeptide repeats)蛋白表達基因約在20多年前被發現[1,2]，但是對PPR家族的系統研究，是從擬南芥()基因組測序之后才開始。對擬南芥基因組測序發現，將近31%的基因與已知功能的基因不同，而在未知功能的基因中，PPR基因占比6%，約有450個成員構成這個龐大的家族。由于與已知的TPR (tetratricopeptide repeat)蛋白結構域相似，學者們將其命名為PPR蛋白，TPR蛋白是一類蛋白結合型蛋白家族，而PPR蛋白屬于RNA結合蛋白，這兩種蛋白可以通過保守的氨基酸殘基進行區分。PPR蛋白廣泛存在于真核細胞中，原核生物只有在少數病原體和共生菌中存在，因此PPR蛋白是一類真核細胞特有的蛋白家族[3]。

近年來，在研究各種類型突變體的過程中發現PPR蛋白在植物不同生長發育階段發揮重要作用，因此有關植物PPR成員的功能研究越來越多。目前，PPR大部分成員被定位于線粒體和葉綠體，對細胞器基因的轉錄后調控起重要作用，主要包括RNA剪接、RNA穩定、RNA切割、RNA翻譯和RNA編輯[3]。一些PPR基因突變后，下游的RNA底物加工異常，導致產生異常的轉錄本，進而影響了葉綠體和線粒體的正常發育，從而影響植物光合作用和呼吸作用等重要生物進程，導致植物生長發育受阻。如此，研究龐大的PPR家族成員影響植物生長的分子機理至關重要。

對PPR家族分子機理的研究關鍵是探尋其所作用的RNA底物及作用方式。植物線粒體及葉綠體的基因組較小，且各基因在基因組的位置已研究的較為清楚，利用成熟的分子生物學手段，可較快速地定位目標RNA，并確定影響植物生長發育的機理。因此，掌握PPR基因對底物的作用機理及作用方式有助于探究并總結PPR家族對植物生長發育的作用。本文以水稻()、擬南芥、玉米()為例，總結了目前多個PPR成員的分子作用機理及不同的PPR突變體對植物形態建成的影響，以期為未來研究龐大的PPR家族成員提供理論依據及研究方向。

1 PPR蛋白分類

PPR蛋白主要分為P類和PLS類，其中P類是由相對保守的35個氨基酸串聯重復排列而成，PLS類成員則是由P基序(35個氨基酸)、L (longer)基序(35～36個氨基酸)和S (shorter) (31～32個氨基酸)基序為一個重復單位排列而成[3]。此外，PLS類成員按照其C端的不同氨基酸序列又分為E亞類、E+亞類和DYW亞類。E和E+結構域包含34個氨基酸，這種結構類似于TPR蛋白，DYW結構域包含胞苷脫氨酶序列，其命名來源于3個保守的氨基酸—天冬氨酸(D)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)[3]。

2 PPR蛋白分子作用機理

PPR蛋白作為一種RNA結合蛋白，對mRNA轉錄后加工起著關鍵作用。P類成員主要參與RNA的剪接、穩定、切割和翻譯過程，PLS類成員主要參與RNA的編輯過程。

2.1 PPR蛋白參與順式和反式剪接

RNA剪接是指把內含子從前體mRNA (pre- mRNA)上移除，并將外顯子連接起來的過程。與細胞核基因不同，葉綠體和線粒體基因的外顯子并非連續分布在環狀基因組上，而是包含多個多順反子結構，需要順式剪切和反式剪切形成多個轉錄中間產物，并分別去除內含子，才能將外顯子連接起來形成成熟mRNA。發生在一條前體mRNA之間的剪接，稱為順式剪接(-splicing)，多見于真核生物細胞核基因的剪接；發生在不同前體mRNA之間的剪接，稱為反式剪接(-splicing)，反式剪接可產生某個成熟mRNA的中間轉錄物，反式剪接多見于對葉綠體和線粒體基因組的初始轉錄物進行加工的過程中[4]。

需要剪切的葉綠體和線粒體基因內含子在不同物種中數量不同，被歸類為I型內含子和II型內含子，其中大部分是II型內含子[4]。I型內含子由10個結構域構成(P1～P10)，作用于RNA折疊，促進剪切和連接；II型內含子由6個雙螺旋結構域構成(I～VI)，形成復雜的空間結構，構成剪切的活性識別位點，每個結構域都有獨特的作用，其剪切方式是經過兩步轉酯反應完成的，剪切機制類似于細胞核中的剪接體[5]。I型內含子和II型內含子的區別主要是二級結構和第一步剪切步驟的化學反應機制不同[6]。

II型內含子在植物中的分布較普遍，以水稻、玉米和擬南芥為例，擬南芥線粒體基因組9個基因共含有23個內含子，水稻和玉米線粒體基因組8個基因共含有22個內含子，且均為II型內含子。其中需要順式剪切的內含子有17個(包含擬南芥中的一個內含子)，需要反式剪切的內含子有6個[5]。目前，參與RNA剪接的PPR蛋白大多參與、、的順反式剪切，參與、、RNA剪切的PPR蛋白還未見報道(圖1)[7～28]。擬南芥葉綠體基因組有20個II型內含子和1個I型內含子()，分布在18個基因中；水稻和玉米葉綠體基因組有17個II型內含子和1個I型內含子()，分布在16個基因中[29]。這些內含子中只有的一個內含子屬于I型內含子，其余均為II型內含子。此外，根據結構特異性和功能差異性，II型內含子可分為IIA組、IIB組、IIC組和IIE/F組[30]。在植物中，依據內含子的二級結構不同，Michel等[31]將葉綠體的II型內含子分為IIA和IIB兩組。葉綠體基因只有的第一個內含子需反式剪切，且屬于B組內含子，其余所有剪切方式均為順式剪切。葉綠體中報道參與RNA剪接的PPR蛋白數量相對較少(圖2)[32～42]。

圖1 水稻、玉米和擬南芥中參與線粒體內含子剪接的PPR蛋白

水稻和玉米包含22個內含子，擬南芥包含23個內含子，蛋白名稱右上角為參考文獻。Zm：玉米；Os：水稻；At：擬南芥。圖中展示了9個包含內含子的基因結構圖，擬南芥比水稻和玉米多了1個內含子(的內含子，虛線標注)，黑色方框代表外顯子(E)，閉合曲線表示順式剪接的內含子，未閉合的曲線代表反式剪接的內含子。

圖2 水稻、玉米和擬南芥中參與葉綠體內含子剪接的PPR蛋白

水稻和玉米包含18個內含子，擬南芥包含21個內含子，蛋白右上角為參考文獻。Zm：玉米；Os：水稻；At：擬南芥。是唯一一個I型內含子，其余均為II型內含子，且II型內含子分為兩個亞組(Subgroup II A和Subgroup II B)。虛線左側的內含子為B組內含子，虛線右側的內含子為A組內含子。圖中展示了包含內含子的基因結構圖，擬南芥比水稻和玉米多了3個內含子(的1個內含子，的2個內含子，虛線標注)。黑色方框代表外顯子(E)，閉合曲線表示順式剪接的內含子，未閉合的曲線代表反式剪接的內含子。

參與RNA剪接的PPR蛋白突變后，通常會造成成熟(spliced)的mRNA含量減少或缺失，而未剪接(unspliced)的前體mRNA含量增多。根據目前的報道，還沒有一個PPR蛋白可參與某個基因所有內含子的剪接，可見一個基因，或者某個特定內含子，是由多個PPR蛋白和其他RNA加工類蛋白共同完成的，且這些RNA加工蛋白的氨基酸序列并不保守，這種現象反映了進化的多樣性和剪接過程的復雜性。在進化過程中，不同物種線粒體和葉綠體基因組的內含子發生自然突變，進而招募相應的核編碼蛋白(如PPR蛋白)進行剪接加工。若內含子在不同物種中的突變發生在單子葉和雙子葉植物進化之后，則同一個內含子的剪接可能需要不同的PPR蛋白；若內含子的突變發生在單雙子葉植物進化之前，則作用于內含子的PPR蛋白在不同物種中具有保守性。此外，同一個PPR蛋白也可參與多個基因內含子的剪切過程，這體現了PPR蛋白對下游底物作用機制的復雜性。

2.2 PPR蛋白參與mRNA穩定

PPR 蛋白穩定底物RNA主要是保護底物RNA免受核酸外切酶的非特異性切割。其作用機理是PPR蛋白結合于初始轉錄物的5?或3?末端，或者結合于多順反子反式剪切中間轉錄物的5?或3?末端，作為一種“障礙”，阻擋5?或3?外切酶的非特異性切割，穩定mRNA不被降解。同時，由于所結合位置是固定的、特異性的，所以PPR也界定了轉錄物的5?或3?末端[43]。因此，PPR蛋白參與mRNA的穩定，既確定了轉錄物的末端，又保證了轉錄物免于降解，具有雙重作用。由于線粒體和葉綠體基因組由多順反子組成，因此界定正確的5?或3?末端這一功能對成熟mRNA的形成至關重要。

參與RNA剪接的PPR蛋白功能缺失時，通常會造成成熟的底物RNA轉錄本減少或缺失，未剪切的中間轉錄本增加，表明剪接過程受阻。相反，參與mRNA穩定的PPR蛋白功能缺失時，雖然也會阻止mRNA成熟，但是未剪切的轉錄本并未增多，反而是減少的，由于未剪切的中間轉錄物被5?或3?外切酶非特異性切割，穩定性降低并缺失，導致不能形成功能正常的成熟mRNA。因此，該分子機理是鑒定PPR蛋白參與底物RNA的剪接或穩定進程的依據。

葉綠體中同時擁有5?和3?核酸外切酶，PPR蛋白可結合于轉錄物的5?或3?末端，參與mRNA的穩定(圖3A)。玉米ZmPPR10可結合于-、-基因間區[44]；此外，玉米ZmATP4、ZmCRP1、擬南芥AtHCF152可分別作用于-基因間區、-基因間區、-基因間區[45～47]，上述4個蛋白均能同時阻止5?和3?核酸外切酶的非特異性切割。擬南芥AtMRL1、AtPGR3、玉米ZmPPR103分別結合于、、的5?UTR，阻止5?核酸外切酶的非特異性切割[48～50]。ZmPPR5較為特殊，它結合于的3?內含子，促進的穩定，并促進剪切[33]。

線粒體基因組在進化過程中經過動態的進化和重排，只有3?核酸外切酶，而無法檢測到5?核酸外切酶活性[51]。所以，在線粒體中，參與mRNA穩定的報道多集中于阻止3?核酸外切酶的切割(圖3B)，而5?端的加工為一種切割作用(見下文)。線粒體的成熟過程經過3個反式剪切過程，所以其前體轉錄物包含4個中間產物，AtMTSF2和AtPPR19均可結合于第二個前體int1b-exon2-int2-exon3-int3a的內含子3a處，阻止3?核酸外切酶的切割[52,53]；AtMTSF1結合于的3?UTR，免受3?核酸外切酶的非特異性切割[54]；ZmPPR78比較特殊，不參與穩定反式剪切的中間轉錄物，而是直接穩定成熟的轉錄物，且突變后，成熟轉錄本中缺失5?ATG和3?TGA的不完整轉錄本增多，猜測其可通過阻止3?核酸外切酶的切割穩定3?端，但是由于未能檢測到5?核酸外切酶活性，其縮短的5?端轉錄本還未能解釋。由此可見，在線粒體中仍然有未被發現的mRNA加工進程待挖掘[55]。

2.3 PPR蛋白參與mRNA切割

PPR蛋白參與RNA切割包含兩種方式：核酸外切酶方式和核酸內切酶方式。較典型的是PPR編碼的RF (restorers of fertility)蛋白可以切割育性相關的線粒體RNAs，在三系配套育種工作中發揮重要作用，也是系譜法選育品種的理論依據。細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)是一種母系遺傳的線粒體遺傳缺陷，產生不育的花粉，目前已在200多種高等植物中觀察到CMS。與CMS相關的線粒體基因均是以嵌合體的結構分布在線粒體基因組上[57]，這種有缺陷的線粒體基因編碼的蛋白，使植物特定發育階段的組織生長受阻從而產生不育的花粉。用包含RF蛋白的恢復系與不育系雜交產生F1雜交種，在F1的植株中攜帶育性恢復基因，即可恢復植株的雄性育性，其分子機理即PPR蛋白可對線粒體目標RNA正確切割，進而不能產生有毒蛋白，從而恢復F1雜交種的育性。目前大部分的RF蛋白都是PPR蛋白，包括矮牽牛花() RF[58]、油菜() Rfk1[59]、蘿卜() Rfo[60]、高粱() PPR13[61]、水稻RF1[62]。以水稻BT-CMS育性恢復基因為例，該基因包含兩個位于第10號染色體的PPR基因和。BT-CMS線粒體基因組包含兩個拷貝的，分別為和。其中，下游為，ORF79蛋白是一個特異性表達于小孢子的毒性蛋白。的初始轉錄物為2 kb，Rf-1A參與3?末端和5?端基因間區的切割，加工后分為1 kb和0.4 kb，而BT-CMS中初始轉錄物不能正確切割，產生毒性蛋白導致不育；Rf-1B降解轉錄物，使植株不受毒性蛋白ORF79侵害，從而恢復育性，Rf-1A的作用上位于Rf-1B[63]。

圖3 水稻、玉米和擬南芥中參與葉綠體(A)和線粒體(B)轉錄物穩定的PPR蛋白

蛋白右上角為參考文獻。藍色方框代表外顯子，閉合曲線代表順式剪接的內含子，未閉合的曲線代表反式剪接的內含子，藍色直線代表基因間區。

PPR蛋白參與5?端切割的具體機制還未研究清楚，Barkan等[43]指出，可能的機制是切割位點的順式作用元件可與PPR蛋白的結合位點形成一個RNA結構，當PPR蛋白結合于目標位點時，可暴露順式作用元件，繼而通過一種未知機制促進5?端的加工成熟過程。擬南芥中與RF同源的蛋白稱之為RFLs (restorers of fertility like)，其中RPF1[64]作用于的5?UTR區、RPF2[65]作用于和的5'UTR區、RPF3[66]作用于的5?UTR區、RPF5[67]作用于和26S RNAs的5?UTR區，促進鄰近的5?端形成。鑒于線粒體5?→3?核酸外切酶的缺失，這些蛋白功能喪失后，通常形成5?端異常長的轉錄本。

除此之外，一些包含DYW結構域的PPR蛋白本身就具有核酸內切酶的活性。CRR2是一個DYW型的PPR蛋白，可作為一種核酸內切酶，切割基因間區，參與的成熟[68]，CRR22和CRR28在體外也被證實具有核酸內切酶的活性[69]。此外，PPR蛋白家族的一小部分成員C端包含SMR (small MutS-related)結構域，SMR結構域具有核酸內切酶活性[70]。目前PPR成員中，只發現SOT1的C段SMR結構域具有內切酶的活性，AtSOT1可識別23S–4.5S rRNA前體5?末端13 bp的序列，正確切割前體末端形成成熟的23S及4.5S rRNA[71]。ZmPPR53是AtSOT1的同源蛋白，PPR53直接結合于23S rRNA 5?端上游70 nt的位點，穩定23S rRNA不被5?→3?外切酶切割，也可直接結合于5?端上游66 nt的位點，增加的翻譯效率，但是其C端的SMR結構域功能還未能解釋清楚[72]。

2.4 PPR蛋白參與mRNA翻譯

PPR蛋白參與mRNA的翻譯通常結合于底物的5?UTR區，促進底物RNA與核糖體的結合，從而激活或者抑制翻譯。ZmPPR10[44]、AtPGR3[49]、ZmATP4[47]可分別激活的翻譯過程，ZmCRP1[45]可同時激活和的翻譯。

葉綠體中，PPR蛋白參與mRNA翻譯的經典例子是PPR10。PPR10激活翻譯的研究為了解葉綠體PPR介導的翻譯激活的潛在機制提供了基礎。在PPR10未結合的情況下，PPR10的結合位點和的核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)形成一個RNA發夾結構，PPR10結合后，可使RBS暴露，促進和核糖體結合，激活翻譯，同時結合到該位點的PPR10也阻斷5?→3?外切核糖核酸酶活性，從而兼具穩定的作用[43]。

線粒體中，PPR蛋白影響翻譯的研究較少，且線粒體mRNA的核糖體結合位點不能被清楚認定[73]，這就需要UTR特異性結合的PPR和其他蛋白質識別這些結合位點，對線粒體基因表達進行特異性的調節，例如ZmMPPR6結合于線粒體mRNA的5?UTR的3?末端，5?UTR的RNA二級結構遮擋了起始密碼子，從而抑制翻譯起始，MPPR6可使這種二級結構松散，從而保證了與核糖體的正確結合，激活翻譯[74]。

除了激活翻譯外，參與mRNA切割的RF蛋白可抑制底物RNA的翻譯。蘿卜的不育花器官中成熟毒蛋白ORF138的含量比根中高10倍，而含育性恢復基因Rfo的可育植株中，花器官和其他組織的毒蛋白含量均顯著下降。但是，不管在可育或不育的植株中，轉錄物含量不受影響，這表明Rfo影響了的翻譯或翻譯后進程，使蛋白表達量在不育和可育植株中含量不同，但是調控翻譯的機制還未可知[60]。

2.5 PPR蛋白參與mRNA編輯

RNA編輯是一種發生在轉錄后核苷酸特異位點的加工修飾現象，包括核苷酸的插入、刪除和轉換，其中核苷酸的轉換包括兩種方式，A→I和C→U。A→I的編輯僅由作用于RNA的腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on RNA, ADAR)完成，主要發生在動物、真菌及細菌中[75]；高等植物中RNA編輯主要發生在線粒體與葉綠體中，C→U核苷酸替換的RNA編輯是高等植物中的普遍方式，該方式是由RNA編輯體統籌，通過對初始轉錄物編碼的C殘基進行脫氨基來完成的[76]。C→U的改變，(1)一般發生在密碼子的第一個或者第二個堿基位點，造成氨基酸的改變；(2)產生新的AUG起始密碼子或者消除初始轉錄物的無義終止密碼子，從而形成穩定成熟的mRNA，翻譯為有功能的蛋白；(3)編輯后的位點可能產生RNA二級結構，影響mRNA的剪接和穩定[77]。C→U RNA 編輯可以影響細胞器蛋白質的序列、改變調節基序、RNA-蛋白質相互作用或RNA二級結構，在RNA 加工過程中發揮重要作用[77]。目前的研究已確定水稻、玉米、擬南芥中所有的編輯位點，以水稻為例，線粒體共485個編輯位點，分布在36個線粒體基因上(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide/BA000029)；葉綠體共21個編輯位點，分布在11個葉綠體基因上[78]，本文列出了目前在水稻、玉米、擬南芥中報道的部分參與RNA編輯的PPR蛋白及對應的編輯位點[79～102](表1)。

RNA編輯體統籌RNA編輯過程，組成成員包括：PPR蛋白、MORFs (multiple organellar rna editing factors)蛋白、ORRM (organelle RNA recognition motif-containing)蛋白、PPO1 (protoporphyrinogen IX oxidase 1)蛋白、OZ1 (organelle zinc finger 1)蛋白[75]。其中PPR蛋白的PLS家族成員就是其中一種，主要作為反式作用因子，結合到編輯位點上游5～20個核苷酸的順式作用元件上，使編輯位點被辨認出來，招募RNA編輯酶催化C→U的反應[91]。PLS家族成員C端的E1和E2結構域類似于PPR基序，可能通過蛋白互作或者結合RNA底物的方式參與編輯過程[103]。DYW結構域具有脫氨酶活性，可直接參與C→U編輯。

一個PPR蛋白可參與多個底物RNA的多個位點的編輯，同時某個特定RNA的編輯位點，可被不同的PPR蛋白識別。RNA編輯位點的編輯效率并不是100%，平均約有80%。不同組織或不同發育條件下，RNA編輯效率均會受影響[104]。

此外，PPR蛋白可與MORFs蛋白互作共同協作完成RNA的編輯過程。MORFs是葉綠體和線粒體編輯體成員，擬南芥中共10個成員，其中MORF1、3、4、6、7定位于線粒體，MORF2、9定位于葉綠體，MORF5、8雙定位于線粒體和葉綠體。不同于PPR蛋白，MORF蛋白參與RNA編輯的過程是非特異性的，一個MORF蛋白即可參與相應細胞器中所有編輯位點的編輯過程。PPR蛋白的P基序或E1、E2結構域與MORF蛋白的N端或者中間區域互作，在不同的編輯位點可裝配特異的蛋白復合體。MORF蛋白還可與PPR蛋白的L基序互作，減小PPR蛋白構象上P基序和S基序的距離，增加PLS結構域與底物RNA的親和性[105]。

表1 水稻、玉米和擬南芥中部分參與葉綠體和線粒體RNA編輯的PPR蛋白

2.6 PPR蛋白通過特異的分子機制識別底物RNA

PPR蛋白的P、L、S基序分別具有保守的氨基酸位點，能區分不同的基序類別，并確定每個PPR重復的起始氨基酸[3]。Cheng等[106]發現，PPR基序識別下游RNA底物具有特異的分子機制。若PPR基序第五位的氨基酸是天冬酰胺(N)，則對應的PPR基序結合嘧啶，若為絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)，則結合嘌呤。此外，PPR基序的最后一位氨基酸是天冬氨酸(D)，則結合尿嘧啶或鳥嘌呤，若為天冬酰胺(N)，則結合胞嘧啶或腺苷酸。綜上所述，每個PPR基序的第五位和最后一位氨基酸決定了所結合的RNA堿基。基于此規律，改變擬南芥PPR10對應位置的氨基酸就會改變對應的RNA識別位點[107]。

這種識別方式也適用于PLS型PPR蛋白，該類型蛋白最后一個S基序與編輯位點前的第4位核苷酸結合，該位置允許胞苷脫氨酶活性特異性作用于待編輯的胞苷。位于編輯位點上游5～20個核苷酸的順式作用元件是PLS型PPR蛋白的識別位點[77]。PPR56可作為PLS型PPR蛋白特異性識別底物的模式蛋白，PPR56第五位與最后一位氨基酸的組合與相對應堿基可歸納為以下規律：T/S+N: A, T/S+D: G, N+N: C/U, N+S: C>U, N+ D: U>C，這與其底物和對應的順式作用元件相吻合[77]。

值得注意的是，這種結合機制并不適合所有的PPR蛋白。一些P類家族成員在每個重復之間可能存在多余的氨基酸殘基，并不是保守的每35個氨基酸重復緊密相連。而且每個重復第五位的氨基酸和最后一個氨基酸并不是保守地按照上述規律排列，不同的PPR蛋白差異很大，所以還需進一步補充這種分子機制，完善PPR蛋白結合底物RNA的規律。

3 PPR蛋白對細胞器發育的影響

3.1 PPR蛋白影響線粒體和葉綠體發育

幾乎所有PPR突變體表現出的表型均是由一種或幾種線粒體或葉綠體基因產物的功能缺失。盡管PPR家族成員很多，但不同家族成員之間的功能幾乎沒有冗余，不同物種中某些同源的PPR蛋白也具有不同的作用底物。PPR突變體的表型主要包括：光合缺陷[35,45,48,68]、葉片發育異常[108]、色素積累[109,110]、生長受阻[8]、胚或胚乳發育異常[7,9,10]、脫落酸信號途徑受損[111]和胞質雄性不育[58～62]。

在真核細胞中，線粒體是一種半自主性細胞器，有自身的基因組。在進化過程中，線粒體大部分基因整合到宿主細胞核基因組中，經過轉錄翻譯后，轉運到線粒體，參與線粒體代謝和線粒體基因表達調控[112]。陸生植物線粒體基因組包含60～70個基因，這些基因編碼的蛋白包括tRNAs、rRNAs、核糖體蛋白、復合體I(NADH脫氫酶)亞基、復合體III(細胞色素C還原酶)亞基、復合體IV(細胞色素C氧化酶)亞基、ATP合酶亞基和細胞色素C合成酶亞基等。

線粒體為植物發育提供了能量，其功能喪失對植物生長有害。線粒體PPR蛋白分子功能的確定有助于闡明RNA加工機制以及氧化磷酸化機制的組裝。復合體I嵌入線粒體內膜并介導電子從NADH轉移至泛醌[113]，是電子進入電子傳輸鏈的主要入口點，多個研究表明PPR參與的剪接缺陷能影響復合體I的裝配和穩定[13,114,115]。Nad1、Nad2和Nad4蛋白是復合物I的膜臂成分[116]，Nad1形成醌結合位點，Nad2是復合物I中質子轉移的位點，而Nad4、Nad5形成質子易位子之一，并且在結構上與K或Na+/H+逆向運輸蛋白有關。由于需要復合物I中Nad1、Nad2、Nad4、Nad5參與質子轉移和醌鍵結合，PPR蛋白表達受阻而導致的、異常轉錄都會嚴重降低復合物I的含量，使活性顯著降低[10,12,22,25]。

PPR蛋白ZmEMP8、ZmDEK43、AtPPR19[12,23,52]功能異常時，復合體I亞基功能的缺失還可導致細胞色素途徑受損，線粒體氧化磷酸化效率降低，導致植物出現代謝問題[117]，誘發交替途徑起始[24]，導致交替氧化酶基因的轉錄水平提高。此外，OsNPPR1、OsFlo10[8,118]突變后，由于電子傳遞效率降低，使得呼吸鏈產生的ATP含量顯著下降[117]。氧化磷酸化中產生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)在觸發植物細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)中起關鍵作用[119]。通常，PCD從胚乳的中部開始，然后擴散到外圍[120]。PPR突變體由于氧化磷酸化進程的異常，導致產生過量的ROS，使突變體胚乳比野生型更早的發生PCD，這會干擾淀粉和貯藏蛋白的合成[121]，所以定位于線粒體的PPR蛋白突變通常會造成胚乳粉質和皺縮的表型。可見，線粒體PPR功能缺陷型突變體，會導致線粒體發育受損，影響線粒體功能。

真核細胞中，葉綠體是光合作用的主要場所，其基因組包含約100個基因左右，這些基因主要參與光合作用、ATP合成和基質中蛋白的轉錄翻譯和降解過程。葉綠體光合作用需要光合電子傳遞鏈，由3種復合物PS I、PS II和Cytb6f組成。PPR蛋白HCF152[46]、MRL1[48]、PGR3[49]等突變，通過影響光合電子傳遞鏈復合物的成員轉錄后加工，從而造成葉綠體發育異常；葉綠體ATP合酶是位于類囊體膜上的一個多亞基復合體，它利用光合作用電子傳遞產生的質子動力將ADP轉化為ATP。葉綠體ATP合酶由CFo和CF1模塊組成，其中由葉綠體基因參與的亞基產生于兩個多順反子葉綠體轉錄單位和[122]。PPR蛋白WSL4[32]、ATP4[47]通過影響合酶成員的剪接和翻譯，影響葉綠體中ATP的合成過程；此外，在葉綠體基質中存在葉綠體蛋白酶體clp復合體、葉綠體RNA聚合酶復合體以及一些核糖體蛋白[56]。PPR蛋白WSL[42]、CRR2[68]、CLB19[109]的突變影響這些途徑葉綠體mRNA的成熟過程。

3.2 PPR蛋白在細胞核中的功能

有一類特殊的PPR蛋白，亞細胞定位于細胞核，包括GRP23、PNM1、SORA1和OsNPPR1。其中GRP23只定位于細胞核，與RNA聚合酶II亞基III互作，突變后致死[123]。PNM1雙定位于細胞核和線粒體，其突變體的致死表型只與線粒體定位有關，在細胞核中PNM1可與轉錄因子TCP互作，調控線粒體氧化磷酸化過程相關的核基因表達[124]。GRP23與細胞核RNA聚合酶II亞基III互作，PNM1與細胞核轉錄因子TCP8和NAP1互作，說明PPR定位于細胞核可以影響核mRNA的轉錄和轉錄后調控進程。此外，TCP8轉錄因子特異性的轉錄與線粒體氧化磷酸化途徑相關的細胞核基因[125]，說明定位于細胞核的PPR蛋白可能通過參與定位于細胞器的核基因的轉錄后調控過程，參與細胞器的代謝過程。在水稻中，OsNPPR1是定位于細胞核的PPR蛋白，但卻影響了線粒體的功能，猜測可能是參與了細胞核中與線粒體發育相關基因的轉錄后調控而間接影響線粒體發育[118]；SOAR1雙定位于細胞核和胞質，參與ABA信號途徑，作用于ABAR1下游和ABI5的上游[126]。

4 PPR功能展望

本文系統綜述了水稻、玉米、擬南芥中PPR蛋白參與轉錄后調控的分子機理和性狀表現。PPR蛋白可參與整個植物生育期的發育過程，影響植株的生長，對植物的正常長成有重要作用。近年來，對PPR成員的功能研究也越來越多。但是，仍有一些重要的科學問題沒有解決：(1)龐大的PPR蛋白家族成員是否僅調控100多個細胞器基因的表達；(2) E和E+型的PLS PPR蛋白結合底物后，招募編輯酶的分子機制還未知；(3)蘿卜的不育花器官中成熟毒蛋白ORF138的含量極高，而含育性恢復基因Rfo的可育植株中，各組織毒蛋白含量均顯著下降。但是，不管在可育或不育的植株中，轉錄物含量不受影響，雖然參與翻譯的過程，但是調控翻譯的機制還不清楚；(4)參與RNA切割的線粒體PPR蛋白的切割機制還未知；(5)雖然通過對PPR10的分子機理進行系統的研究，發現了可能存在的PPR基序與底物結合的“密碼”[99]，但是由于PPR家族各成員之間保守性相差較大，所以“密碼”并不適用于所有的PPR成員，是否有更精細明確的結合方式存在還有待探索。

細胞器基因的正常表達，需要PPR家族成員協同工作，研究PPR蛋白可定向控制細胞器基因的表達，為利用生物工程技術，改良作物光合作用和呼吸作用進程提供理論基礎。

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The role of PPR proteins in posttranscriptional regulation of organelle components in plants

Yuanyuan Hao, Xiangqian Zhao, Fudeng Huang, Chunshou Li

Pentatricopeptide repeat (PPR) proteins constitute one of the largest protein families in land plants. They are sequence-specific RNA-binding proteins and play key roles in posttranscriptional processes within organelles. Their combined actions have profound effects on chloroplast photosynthetic electron transport chain and mitochondrial respiratory chain, affecting photosynthesis and respiration respectively, and ultimately on yield, fertility, and grain quality. Over the past decade, much has been learned about the molecular functions of these proteins on plant growth and development. However, due to the large size of this protein family, the functions of most membersremain largely unknown.Here, we summarize the molecular mechanisms of PPR proteins functions on organelle genes, and effects on development of organelles and plants. Problems that need to be resolved are also identified. This article will provide a theoretical basis for understanding the functions of PPR protein family and genetic improvements of grain yield and quality.

PPR proteins; post-transcriptional regulation; organelle metabolism; plant growth and development

2021-06-30;

2021-08-20

國家自然科學基金項目(編號：32001524)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 32001524)]

郝媛媛，博士，助理研究員，研究方向：稻米品質的改良和分子機理。E-mail: 499085663@qq.com

李春壽，學士，研究員，研究方向：秈型雜交稻的選育。E-mail: lichunshou@126.com

10.16288/j.yczz.21-233

2021/10/26 17:08:41

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20211026.1131.002.html

(責任編委: 宋任濤)