黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)成體造血器官頭腎和體腎轉(zhuǎn)錄組比較研究*

鐘愛華 代小新

黃顙魚()成體造血器官頭腎和體腎轉(zhuǎn)錄組比較研究*

鐘愛華 代小新

(浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 舟山 316022)

硬骨魚類具有獨(dú)特的免疫系統(tǒng), 其頭腎和體腎是重要的造血和免疫器官。為探索黃顙魚頭腎和體腎造血和免疫功能異同, 采用Illumina HiSeq NovaSeq 6000測序平臺(tái)對黃顙魚頭腎和體腎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組高通量測序; 測序序列經(jīng)質(zhì)控、組裝后, 共獲得59 979個(gè)轉(zhuǎn)錄本(transcript), N50為3 919 bp; 獲得的轉(zhuǎn)錄本在NR、GO、KEGG、Swiss-Prot和Pfam數(shù)據(jù)庫中比對和注釋, 共有24 487個(gè)Unigenes獲注釋。差異表達(dá)基因分析顯示, 1 112個(gè)基因在頭腎中上調(diào), 包括KIT配體、早期B細(xì)胞因子1、Toll樣受體1和2等免疫相關(guān)基因; 2 737個(gè)基因在體腎中上調(diào), 如C-C趨化因子19和25、補(bǔ)體5和9、白細(xì)胞介素17受體C、RIG-I和白細(xì)胞介素27等免疫相關(guān)基因, 部分抗體重鏈可變區(qū)編碼基因和抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因僅在體腎中表達(dá)。結(jié)果表明, 黃顙魚頭腎和體腎中免疫相關(guān)基因表達(dá)具有差異性, 兩者造血和免疫功能具有組織特異性。研究結(jié)果有助于黃顙魚頭腎和體腎造血和免疫功能研究, 可為黃顙魚病害防治提供基礎(chǔ)資料。

黃顙魚; 頭腎; 體腎; 轉(zhuǎn)錄組測序

硬骨魚類免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物不同, 硬骨魚類骨髓沒有造血功能, 取而代之的是頭腎和體腎, 成體時(shí)頭腎一般不具有腎小管, 因而沒有排泄功能; 而體腎既有排泄功能又有造血功能。作為重要的中樞免疫器官, 頭腎和體腎不僅能支持造血細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟, 維持血細(xì)胞相對穩(wěn)態(tài), 還參與機(jī)體免疫防御反應(yīng), 以阻止和清除入侵病原體及其毒素(Zwollo, 2005)。

黃顙魚()隸屬于輻鰭魚綱、鯰形目、鲿科、黃顙魚屬, 俗名嘎牙子、黃姑子、黃臘丁、黃骨魚等, 廣泛分布于我國廣大江河流域。黃顙魚是一種耐低氧、廣溫性淡水魚類, 溶氧大于2 mg/L、水溫1—38 °C之間均能正常生存, 諸多優(yōu)點(diǎn)使其成為重要的淡水養(yǎng)殖魚類。中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示, 2017年全國黃顙魚產(chǎn)量為480 032 t, 2018年產(chǎn)量為509 610 t, 2019年產(chǎn)量為536 964 t, 連續(xù)兩年產(chǎn)量不斷增加。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大, 高密度養(yǎng)殖環(huán)境中, 黃顙魚常常感染細(xì)菌、寄生蟲以及病毒, 如愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等, 輕則影響黃顙魚生長, 重則導(dǎo)致其大規(guī)模死亡(Li, 2018)。目前有關(guān)黃顙魚研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)、人工繁殖、病害防控等方面(胡偉華等, 2019; 王國霞等, 2020; 郭勛等, 2020; 藺凌云等, 2020), 筆者在進(jìn)行黃顙魚血細(xì)胞發(fā)生研究時(shí)發(fā)現(xiàn)頭腎中有更多的原紅細(xì)胞, 為了探索頭腎和體腎造血以及免疫功能異同, 筆者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組高通量測序, 以期望探明兩者造血和免疫功能的分子機(jī)制, 為黃顙魚病害防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)用黃顙魚() [體質(zhì)量(200±25) g]來自浙江省寧波市養(yǎng)殖農(nóng)場, 選擇健康無傷、體表無寄生蟲、反應(yīng)敏捷的健康黃顙魚, 帶回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng), 暫養(yǎng)水體為100 L, 溫度(20±2) °C、溶解氧大于5 mg/L。暫養(yǎng)5 d后, 隨機(jī)挑選9尾大小相近的黃顙魚, 丁香酚麻醉后取其頭腎和體腎, 凍存于液氮中用于抽提RNA, 因頭腎較小, 為保證測序質(zhì)量, 每 3個(gè)個(gè)體組成一個(gè)樣本。

1.2 RNA抽提

先采用Trizol (Invitrogen)試劑盒提取頭腎和體腎中總RNA, 然后使用DNase I (TaKaRa)去除基因組DNA, 獲得的RNA樣品用2100 Bioanalyser (Agilent)、ND-2000 (NanoDrop Technologies)檢測質(zhì)量, 以保證合格樣品(OD260/280=1.8—2.2, OD260/230≥2.0, RIN≥9.0, 28S:18S≥1.0, 總量>2 μg)用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 文庫建立和測序

文庫建立采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit (Illumina, San Diego, CA)試劑盒進(jìn)行。首先用帶有Oligo(dT)的磁珠從1 μg總RNA中富集含有poly-A尾巴的mRNA, 再加入片段化緩沖液, 將mRNA隨機(jī)斷裂成200 bp左右的小片段; 接著采用SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen, CA)試劑盒, 加入六堿基隨機(jī)引物(Illumina), 以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA, 然后合成第二鏈, 形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈的cDNA結(jié)構(gòu)為粘性末端, 加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端, 隨后在3′末端加上A堿基, 用于連接Y字形的接頭。獲得的cDNA經(jīng)過15個(gè)PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增試劑盒采用sample preparation Kit (Illumina, San Diego, CA), 采用瓊脂糖電泳篩選200—300 bp的條帶, 經(jīng)TBS380 (Picogreen)定量后, 用于用Illumina HiSeq NovaSeq 6000測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序, 測序讀長為PE150。

1.4 有參考基因轉(zhuǎn)錄組組裝

測序獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw Date)使用SeqPrep v1.3.2去除reads中接頭, 過濾掉不合格的序列后所獲得的序列即為有效數(shù)據(jù)。具體為先去除reads中的接頭序列, 去除因接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads; 然后將序列末端(3′端)低質(zhì)量(質(zhì)量值小于20)的堿基修剪掉, 若剩余序列中仍然有質(zhì)量值小于10的堿基, 則將整條序列剔除, 否則保留; 去除含N(模塊堿基)的reads, 舍棄去接頭和質(zhì)量修剪后長度小于30 bp的序列, 余下的序列為有效數(shù)據(jù)。使用HISAT2軟件將過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)(Clean reads)比對到黃顙魚基因組上, 基因組來自NCBI (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/term=txid1234273), 然后采用StringTie2軟件進(jìn)行組裝, 具體為先將重合的reads對組裝成super-reads, 然后將super-reads比對到參考基因組, 并構(gòu)建剪接(splice)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)圖(graph), 最后將read覆蓋高的路徑進(jìn)行組裝從而形成轉(zhuǎn)錄本(transcript)序列和Unigenes序列。

1.5 基因注釋和功能分析

采用軟件DIAMOND (Buchfink, 2015), 將組裝獲得的Unigenes序列在NCBI-NR (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)、Pfam (http://pfam.xfam.org/)、GO (http://www.geneontology.org)、KEGG (http://www. genome.jp/kegg/)和Swiss-Prot (https://www.uniprot. org/)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(期望值E value<1e-5), 從而全面獲得Unigenes注釋信息。

1.6 差異表達(dá)基因分析

先采用RSEM v1.3.3將Clean reads比對到組裝的Unigene序列上, 獲得每個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列read數(shù)目, 然后計(jì)算TPM (Transcripts Per Kilobase Million)值, 以獲得Unigene的表達(dá)量。采用R軟件包中的Deseq篩選兩組織中表達(dá)量顯著差異的基因, 篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2Fold Change| > 1.5且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05。

獲得的差異表達(dá)基因, 以注釋的所有基因作為參考, 采用Goatools和KOBAS3.0分析差異表達(dá)基因所在的GO類別和KEGG信號通路, 顯著富集的判斷標(biāo)準(zhǔn)為Bonferroni方法對值進(jìn)行校正, 校正的值(FDR)<0.05時(shí), 此GO類別和KEGG信號通路存在顯著富集情況。

1.7 qRT-PCR (實(shí)時(shí)熒光定量PCR)驗(yàn)證

從頭腎和體腎中隨機(jī)挑選出4個(gè)差異表達(dá)免疫基因, 分別為2個(gè)在頭腎中上調(diào)基因以及2個(gè)在體腎中上調(diào)基因, 進(jìn)行qRT-PCR分析。先從3個(gè)生物學(xué)樣本中提取RNA, 然后采用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (諾唯贊)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 采用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (2×) (諾唯贊)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物由Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)(表1), 內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白(), 基因相對表達(dá)量按2–ΔΔCt法計(jì)算(Livak, 2001), 結(jié)果使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析, 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平為<0.05。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增用引物

Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對及組裝

測序后黃顙魚體腎和頭腎中獲得超過8 Gb的原始堿基(raw bases), 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過修剪、過濾不合格序列后, 體腎中獲得超過56 440 624條有效數(shù)據(jù)(clean reads), 頭腎中獲得超過63 788 540條有效序列, 頭腎和體腎有效序列的質(zhì)量得分Q20均大于98%, Q30均大于94%。獲得的有效reads與參考基因組進(jìn)行比對, 體腎中93%以上的有效reads能定位到基因組上, 頭腎中92%的有效reads能定位到基因組上(見表2)。

有效序列經(jīng)組裝后, 共獲得59 979個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 最長轉(zhuǎn)錄本長度為95 343 bp, 轉(zhuǎn)錄本N50值為3 919 bp, 大部分轉(zhuǎn)錄本的長度超過1 800 bp, 有40 134個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 占比66.91% (圖1)。

2.2 功能注釋

組裝獲得的轉(zhuǎn)錄本在五個(gè)數(shù)據(jù)庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、GO和KEGG)中進(jìn)行比對, 以全面獲得轉(zhuǎn)錄本功能信息, 五個(gè)數(shù)據(jù)庫中共注釋24 487個(gè)Unigenes, 注釋率為40.82%, 12 791個(gè)Unigenes在5個(gè)數(shù)據(jù)庫中均獲得注釋(圖2)。五個(gè)數(shù)據(jù)庫中, NR數(shù)據(jù)庫注釋的Unigenes最多。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Tab.2 Statistics of sequencing data

圖1 轉(zhuǎn)錄本長度分布

圖2 基因注釋信息韋恩圖

GO (Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫是一個(gè)對基因和蛋白功能進(jìn)行統(tǒng)一限定和描述的數(shù)據(jù)庫, 在GO數(shù)據(jù)庫中, 共注釋到17 838個(gè)基因, 這些基因分屬于三個(gè)GO類別: 細(xì)胞成分(cellular component, CC)、生物過程(biological process, BP)和分子功能(molecular function, MF), 細(xì)胞成分類別中以“細(xì)胞部分”和“細(xì)胞膜部分”為主, 生物過程類別中以“細(xì)胞過程”和“生物調(diào)節(jié)”為主, 分子功能中以“結(jié)合”和“催化活性”為主(圖3)。

KEGG數(shù)據(jù)庫是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫, 在KEGG數(shù)據(jù)庫中共注釋到15 319個(gè)基因, 這些基因涉及KEGG代謝通路的5個(gè)分支: 環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、細(xì)胞過程(cellular processes)、代謝(metabolism)、機(jī)體系統(tǒng)(organismal systems), 5個(gè)分支中基因數(shù)量最多的類別為: 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、免疫系統(tǒng)(immune system)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)、信號分子與相互作用(signaling molecules and interaction)以及轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝(transport and catabolism) (圖4)。

根據(jù)5個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋的基因信息, 258個(gè)基因在頭腎中特異性表達(dá), 1 974個(gè)基因在體腎中特異性表達(dá)。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋信息, 大部分免疫通路組成元件均在頭腎和體腎中表達(dá), 如Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等組成元件; 但部分免疫相關(guān)基因僅在體腎中表達(dá)(圖5), 包括C-X-C趨化因子9、補(bǔ)體C8γ鏈、抗體重鏈可變區(qū)編碼基因(如可變區(qū)V3-6、V5A、V914等)、抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因(如V-V區(qū)MOPC 149)。

圖3 基因功能GO類別統(tǒng)計(jì)

注: BP為生物過程, CC為細(xì)胞成分, MF為分子功能

圖4 基因功能KEGG類別統(tǒng)計(jì)

注: A為代謝, B為遺傳信息處理, C為環(huán)境信息處理, D為細(xì)胞過程, E為機(jī)體系統(tǒng)

圖5 頭腎和體腎中免疫相關(guān)信號通路基因注釋分析

2.3 差異表達(dá)基因及其GO功能分析

黃顙魚頭腎和體腎Unigenes表達(dá)差異分析表明, 1 112個(gè)基因在頭腎中上調(diào)(圖6), 根據(jù)GO注釋, 頭腎中上調(diào)差異基因注釋到結(jié)合GO類別的最多, 有566個(gè); 其次是注釋到細(xì)胞過程和細(xì)胞部分GO類別, 分別有437和384個(gè)基因。2 737個(gè)基因在體腎中上調(diào)(圖6), 注釋到催化活性GO類別的差異基因數(shù)目最多, 有978個(gè); 其次是注釋到膜部分GO類別, 有890個(gè)基因; 再次是注釋到細(xì)胞過程GO類別, 有819個(gè)基因。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集分析

頭腎中上調(diào)的差異基因富集到263條KEGG代謝通路中, 顯著富集的KEGG通路有皮質(zhì)醇的合成和分泌、甲狀旁腺激素的合成與分泌、B細(xì)胞受體信號通路、MAPK信號通路和ErbB信號通路等(圖7a)。另外, 與免疫功能相關(guān)的顯著富集通路有B細(xì)胞受體信號通路、趨化因子信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、C-型凝集素受體信號通路、Toll受體信號通路以及T細(xì)胞受體信號通路。

圖6 差異表達(dá)基因分布火山圖

注: 藍(lán)色點(diǎn)為頭腎中上調(diào)基因; 紅色點(diǎn)為體腎中上調(diào)基因

體腎中上調(diào)的差異基因富集到324條KEGG代謝通路中, 顯著富集的通路有谷胱甘肽代謝、氧化磷酸化、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、造血細(xì)胞系以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等(圖7b)。與免疫系統(tǒng)相關(guān)的顯著富集通路有產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、造血細(xì)胞系、FceRI信號通路、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

圖7 差異表達(dá)基因富集的KEGG通路

注: a. 頭腎中上調(diào)基因富集的前20條通路; b. 體腎中上調(diào)基因富集的前20條通路

2.5 差異表達(dá)關(guān)鍵造血和免疫基因分析

根據(jù)差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集分析, 頭腎中篩選到差異表達(dá)關(guān)鍵免疫基因有: CD97A、CD97B、CD124、C-C趨化因子受體3 (C-C chemokine receptor type 3)、C-C趨化因子受體7 (C-C chemokine receptor type 7)、C-X-C趨化因子受體1 (C-X-C chemokine receptor type 1)、C-X-C趨化因子受體3 (C-X-C chemokine receptor type 3)、Notch蛋白2和3、白細(xì)胞介素4受體(interleukin 4 receptor)、TGFβ受體1 (TGF-beta receptor type-1)、Toll樣受體1和2 (Toll-like receptor1、2)、KIT配體(KIT ligand)、血紅蛋白亞基α和β、凝血因子Ⅷ (coagulation factor VIII)、早期B細(xì)胞因子1 (EBF transcription factor 1)。

體腎中篩選到差異表達(dá)關(guān)鍵免疫基因有: 部分抗體重鏈可變區(qū)編碼基因、部分抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因、C-C趨化因子19和25 (C-C motif chemokine19、25)、CD9、CD10、CD13、凝血因子II和V (coagulation factor II, V)、羧肽酶B2 (carboxypeptidase B2)、補(bǔ)體因子D (complement factor D)、補(bǔ)體5和9 (complement5、9)、白細(xì)胞介素17受體C (interleukin 17 receptor C)、RIG-I、白細(xì)胞介素27 (interleukin 27)、C-X-C趨化因子14 (motif chemokine ligand 14)、非典型趨化因子受體4 (atypical chemokine receptor 4)、P2Y嘌呤受體12 (P2Y purinoceptor 12)、腫瘤壞死因子受體超家族成員16 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 16)。

2.6 差異表達(dá)關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因分析

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組成基因在頭腎和體腎中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式, 這些通路包括PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路、鈣離子信號通路、Wnt信號通路、ECM信號通路、cAMP信號通路以及AMPK信號通路等。

體腎中篩選到差異表達(dá)關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因有: 囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)、整合素β6和8 (integrin beta 6、8)、Wnt9蛋白、鈣調(diào)蛋白4 (calmodulin 4)。

頭腎中篩選到差異表達(dá)基因有: TAK1、TAK1結(jié)合蛋白1 (TAK1-binding protein 1)、核因子NF-κB p105亞單位(nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α/δ (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha/delta)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC serine/threonine-protein kinase)、肌醇1,4,5-三磷酸受體2型和3型(inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2、3)、絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1, or MAP3K1)、磷脂酰肌醇磷脂酶Cγ1 (phosphatidylinositol phospholipase C, gamma-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β受體1型(TGF-beta receptor type-1)、轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP1 (transcriptional coactivator YAP1)、STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6)、叉頭框蛋白O4 (forkhead box protein O4)。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠性, 采用qRT-PCR分析了4個(gè)差異表達(dá)免疫基因在頭腎和體腎中的表達(dá)(表3)。qRT-PCR獲得的結(jié)果與高通量測序結(jié)果比較表明, Toll樣受體在頭腎中上調(diào), 補(bǔ)體C9和C-C趨化因子19在體腎中上調(diào), 與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的結(jié)果基本一致, 轉(zhuǎn)錄組測序獲得的基因表達(dá)譜具有可靠性。

表3 差異免疫基因轉(zhuǎn)錄組與qRT-PCR結(jié)果分析

Tab.3 Validation of differential expressed genes by qRT-PCR

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序分析

mRNA即信使核糖核酸, 是由一條DNA鏈為模板轉(zhuǎn)錄而來、攜帶遺傳信息并能指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的RNA分子。對一個(gè)物種某一組織或器官中mRNA進(jìn)行全貌分析, 不僅能明了特定組織或器官中表達(dá)的基因及其功能, 還能揭示特定生物學(xué)過程中的分子機(jī)理。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(mRNA-Seq)的出現(xiàn), 使得對特定組織、器官以及個(gè)體mRNA進(jìn)行全貌分析成為可能。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序, 體腎中獲得58 197 718條有效序列, 頭腎中獲得78 436 252條有效序列, 與湖棲鰭蝦虎魚()性腺、克氏原螯蝦()肝臟等轉(zhuǎn)錄組研究中獲得的有效序列相當(dāng)(江紅霞等, 2021; 董忠典等, 2021), 表明本研究獲得的測序數(shù)據(jù)能反映兩組織器官中mRNA表達(dá)譜。獲得的測序序列經(jīng)過組裝獲得轉(zhuǎn)錄本或Unigene后, 才能與已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 對基因功能進(jìn)行注釋, 因此組裝后的轉(zhuǎn)錄本或Unigene長度越長, 注釋結(jié)果越準(zhǔn)確。本研究中60%組裝序列長度超過2 000 bp以上, N50大于3 900 bp, 獲得的基因注釋信息能反映兩器官所表達(dá)的基因及其功能。

3.2 頭腎和體腎造血功能

魚類血細(xì)胞發(fā)生一直是研究熱點(diǎn), 早在1951年, Catton就對幾種硬骨魚類血細(xì)胞發(fā)生過程中形態(tài)變化規(guī)律以及血細(xì)胞發(fā)生部位進(jìn)行了研究, 證實(shí)硬骨魚頭腎和體腎具有造血功能(Catton, 1951)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 頭腎是魚類胚胎時(shí)期的泌尿器官, 隨著個(gè)體發(fā)育失去泌尿機(jī)能, 成體時(shí)成為造血器官, 成體頭腎一般不具有腎單位; 體腎中的造血組織又稱為腎小管間造血組織(renal intertubular hematopoietic tissue), 其造血位置位于腎小管間(Milano, 1997)。黃顙魚頭腎和體腎轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示造血細(xì)胞系通路相關(guān)的重要基因均在頭腎和體腎中表達(dá), 如配體、、受體型酪氨酸蛋白激酶FLT3 ()和DNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶()等, 表明頭腎和體腎是重要的造血器官, 與其他研究相一致(曹伏君等, 2014; 鐘愛華等, 2018)。

形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 多種魚類頭腎和體腎中各種原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞比例并不完全一致。斑點(diǎn)叉尾鮰頭腎和體腎中粒細(xì)胞系(原粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞)和紅細(xì)胞系(原紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞)細(xì)胞比例相近、原淋巴細(xì)胞比例也接近, 但頭腎中有更多幼淋巴細(xì)胞(Fijan, 2002a, b); 達(dá)氏鱘紅細(xì)胞系細(xì)胞在頭腎中比例更高, 體腎中沒有原粒細(xì)胞(Liu, 2017); 軍曹魚體腎中有更多原紅細(xì)胞和原粒細(xì)胞(陳剛等, 2005)。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)黃顙魚頭腎和體腎中血細(xì)胞譜系比例存在差異。KIT配體又稱干細(xì)胞因子, 是造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞生存、增殖和分化的一種重要生長因子(Broudy, 1997), KIT配體在黃顙魚頭腎和體腎中均表達(dá), 表明各類原始造血祖細(xì)胞均存在于兩器官中。人類和小鼠的KIT配體對紅細(xì)胞的正常發(fā)育至關(guān)重要, KIT配體能促使紅系爆式祖細(xì)胞BFU-E向紅系祖細(xì)胞CFU-E細(xì)胞轉(zhuǎn)變(Broudy, 1997; Antonchuk, 2004); 斑馬魚KIT配體功能研究發(fā)現(xiàn)其在紅細(xì)胞系分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用, 斑馬魚KIT配體a是紅系祖細(xì)胞erythroid progenitors體外擴(kuò)增的必須因子(Oltova, 2020); 這些研究表明KIT配體在脊椎動(dòng)物中具有功能保守性。黃顙魚頭腎中KIT配體表達(dá)量顯著高于其在體腎中的表達(dá)量, 且血紅蛋白亞基α和β在頭腎中的表達(dá)量顯著高于體腎中的表達(dá)量, 表明更多紅系祖細(xì)胞在頭腎中分化形成幼稚紅細(xì)胞, 與達(dá)氏鱘形態(tài)學(xué)研究結(jié)構(gòu)相一致(Liu, 2017)。KIT配體也是誘導(dǎo)髓樣干細(xì)胞、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞系集落生成單位CFU-GEMM和淋巴干細(xì)胞增殖和分化的重要因子, KIT配體與受體結(jié)合后, 會(huì)觸發(fā)各種信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng), 包括磷脂酰肌醇3激酶、MAPK、SRC和Jak-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 絲裂原活化蛋白激酶1、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α/δ和STAT6基因均在黃顙魚頭腎中上調(diào), 這意味著更多的淋巴干細(xì)胞、粒系祖細(xì)胞、單核系祖細(xì)胞在頭腎中增殖和分化。早期B細(xì)胞因子1在B細(xì)胞早期分化過程中起重要作用(Lin, 1995), 其功能在動(dòng)物中高度保守, 斑馬魚、鰩和小鼠中DNA結(jié)合域幾乎100%同源(Zwollo, 2011); 在哺乳動(dòng)物中, 早期B細(xì)胞因子1主要存在淋巴干細(xì)胞CLPs、pro-B細(xì)胞以及部分pre-B細(xì)胞中(Hystad, 2007); 早期B細(xì)胞因子1在黃顙魚頭腎中顯著上調(diào), 頭腎中表達(dá)量是體腎中表達(dá)量的10倍以上(log2FoldChange=3.69), 表明更多的淋巴干細(xì)胞和pro-B細(xì)胞存在于黃顙魚頭腎中。

3.3 頭腎和體腎免疫功能

魚類頭腎和體腎除具有造血功能外, 還是重要的免疫器官, 魚類腎造血組織存在黑色素巨噬細(xì)胞中心, 其中有大量含色素的巨噬細(xì)胞, 這些黑色素巨噬細(xì)胞能吞噬降解體內(nèi)各種外源性和內(nèi)源性物質(zhì)以及在免疫應(yīng)答中遞呈抗原(Agius, 2003; Zwollo, 2005; Abdel-Aziz, 2010)。本研究發(fā)現(xiàn), 黃顙魚頭腎和體腎中免疫信號通路相關(guān)基因的表達(dá)存在差異。頭腎中多個(gè)差異表達(dá)基因富集到Toll信號通路, 而Toll信號通路能激活NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子, 從而導(dǎo)致促炎癥因子、抗炎癥細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)(任美玉, 2006)。Toll樣受體如同天然免疫的眼睛, 能識(shí)別各種不同的病原相關(guān)分子模式(PAMP), Toll樣受體1和2能識(shí)別多種細(xì)菌和真菌PAMP, 如脂蛋白、脂壁酸和酵母多糖。Toll樣受體1和2在黃顙魚頭腎中上調(diào), 表明黃顙魚頭腎是識(shí)別和抵抗細(xì)菌和真菌感染的重要器官。

補(bǔ)體是存在于脊椎動(dòng)物血清蛋白質(zhì)中的一組蛋白, 攻膜復(fù)合體C5b6789n能在細(xì)胞膜上形成親水性孔道, 是補(bǔ)體發(fā)揮免疫功能的重要途徑。趨化因子是一類介導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移的細(xì)胞因子。C-C趨化因子19和25、C-X-C 趨化因子14、補(bǔ)體因子D、C5和C9均在體腎中顯著上調(diào), 尤其是補(bǔ)體C9, 其在體腎中的表達(dá)量顯著高于頭腎(表3), 表明體腎是重要的免疫分泌器官。

4 結(jié)論

本研究對黃顙魚成體造血組織頭腎和體腎進(jìn)行了RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序, 并對獲得的測序有效序列進(jìn)行組裝、基因信息注釋和表達(dá)量分析, 頭腎中共注釋20 956個(gè)基因、體腎共注釋24 487個(gè)基因, 1 112個(gè)基因在頭腎中上調(diào), 包括、、、等; 2 737個(gè)基因在體腎中上調(diào), 包括、、、、等, 部分抗體編碼基因僅在體腎中表達(dá); 結(jié)果表明黃顙魚頭腎和體腎在造血和免疫功能上具有差異性, 頭腎中有更多的原始造血細(xì)胞, 體腎在免疫防御中發(fā)揮重要作用。

王國霞, 陳 冰, 孫育平等, 2020. 脫脂亮斑扁角水虻幼蟲粉替代魚粉對黃顙魚幼魚生長性能、營養(yǎng)素沉積率、血清生化指標(biāo)和消化酶活性的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 44(6): 987—998

江紅霞, 劉慧芬, 馬 曉等, 2021. 轉(zhuǎn)錄組測序篩選克氏原螯蝦卵巢發(fā)育、免疫和生長相關(guān)基因. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 45(3): 396—414

任美玉, 2006. Toll樣受體的研究進(jìn)展. 現(xiàn)代免疫學(xué), 26(4): 340—342

陳 剛, 周 暉, 張健東等, 2005. 軍曹魚血液指標(biāo)及血細(xì)胞發(fā)生的觀察. 水生生物學(xué)報(bào), 29(5): 564—570

張健東, 周 暉, 陳 剛等, 2007. 卵形鯧鲹血細(xì)胞發(fā)生的觀察. 水生生物學(xué)報(bào), 31(6): 780—787

苑淑賓, 朱愛意, 江麗華等, 2011. 日本黃姑魚血細(xì)胞發(fā)生的觀察. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 35(9): 1374—1383

郭 勛, 程 珂, 馬春松等, 2020. 飼料中維生素D3的添加水平對黃顙魚幼魚生長和Toll樣受體18、19和21的影響. 水生生物學(xué)報(bào), 44(3): 461—469

胡偉華, 丹 成, 郭穩(wěn)杰等, 2019. 黃顙魚和雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”形態(tài)及性腺發(fā)育的比較. 水生生物學(xué)報(bào), 43(6): 1231—1238

鐘愛華, 儲(chǔ)張杰, 牟 毅等, 2018. 斜帶髭鯛()血細(xì)胞發(fā)生及外周血細(xì)胞化學(xué)染色觀察. 海洋與湖沼, 49(6): 1341—1349

曹伏君, 葉 寧, 羅 杰等, 2014. 長鰭裸頰鯛()血細(xì)胞的發(fā)生. 海洋與湖沼, 45(2): 387—394

董忠典, 黎學(xué)友, 黃承勤等, 2021. 湖棲鰭蝦虎魚性腺轉(zhuǎn)錄組比較分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 45(3): 365—380

藺凌云, 馮東岳, 潘曉藝等, 2020. 黃顙魚擬態(tài)弧菌的鑒定、毒力相關(guān)因子及藥敏特性. 水生生物學(xué)報(bào), 44(4): 799—810

Abdel-Aziz E S H, Abdu S B S, Ali T E S, 2010. Haemopoiesis in the head kidney of tilapia,(Teleostei: Cichlidae): a morphological (optical and ultrastructural) study. Fish Physiology and Biochemistry, 36(3): 323—336

Agius C, Roberts R J, 2003. Melano-macrophage centres and their role in fish pathology. Journal of Fish Diseases, 26(9): 499—509

Antonchuk J, Hyland C D, Hilton D J, 2004. Synergistic effects on erythropoiesis, thrombopoiesis, and stem cell competitiveness in mice deficient in thrombopoietin and steel factor receptors. Blood, 104(5): 1306—1313

Arockiaraj J, Bhatt P, Harikrishnan R, 2015. Molecular and functional roles of 6C CC chemokine 19 in defense system of striped murrel. Fish & Shellfish Immunology, 45(2): 817—827

Broudy V C, 1997. Stem cell factor and hematopoiesis. Blood, 90(4): 1345—1364

Buchfink B, Xie C, Huson D, 2015. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nature Methods, 12(1): 59—60

Catton W T, 1951. Blood cell formation in certain teleost fishes. Blood, 6(1): 39—60

Fijan N, 2002a. Morphogenesis of blood cell lineages in channel catfish. Journal of Fish Biology, 60(4): 999—1014

Fijan N, 2002b. Composition of main haematopoietic compartments in normal and bled channel catfish. Journal of Fish Biology, 60(5): 1142—1154

Han F, Zhang Y, Qin G, 2021. Genome-wide characterization of Toll-like receptors in Japanese meagreand their response to poly (I:C) injection. Aquaculture, 542: 736907

Hystad M E, Myklebust J H, B? T H, 2007. Characterization of early stages of human B cell development by gene expression profiling. Journal of Immunology, 179(6): 3662—3671

Li D P, Xie C X, He X G, 2018. The Success of Yellow Catfish Aquaculture in China: from rare wild fish to popular farmed fish. In: Gui J F, Tang Q S, Li Z J eds. Aquaculture in China: Success Stories and Modern Trends. Hoboken: John Wiley & Sons Ltd, 270—282

Lin H, Grosschedl R, 1995. Failure of B-cell differentiation in mice lacking the transcription factor EBF. Nature, 376(6537): 263—267

Liu Y, Xiao Q, Yang S, 2017. Characterization of hematopoiesis in Dabry’s sturgeon (). Aquaculture and Fisheries, 2(6): 262—268

Livak K J, Schmittgen T D, 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods, 25(4): 402—408

Lu Z J, Zhan F B, Yang M X, 2021. The immune function of heme oxygenase-1 from grass carp () in response to bacterial infection. Fish & Shellfish Immunology, 112: 168—178

Milano E G, Basari F, Chimenti C, 1997. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. General and Comparative Endocrinology, 108(3): 483—496

Ohtani M, Hikima J I, Kondo H, 2011. Characterization and antiviral function of a cytosolic sensor gene, MDA5, in Japanese flounder,. Developmental & Comparative Immunology, 35(5): 554—562

Oltova J, Svoboda O, Machonova O, 2020. Zebrafish Kit ligands cooperate with erythropoietin to promote erythroid cell expansion. Blood Advances, 4(23): 5915—5924

Ou M, Huang R, Luo Q,, 2019. Characterisation of scavenger receptor class B type 1 in rare minnow (). Fish & Shellfish Immunology, 89: 614—622

Wang Q, Wang S W, Zhang Y, 2019. The CXC chemokines and CXC chemokine receptors in orange-spotted grouper () and their expression afterinfection. Developmental & Comparative Immunology, 90: 10—20

Zhu Q, Fan Z J, Cai S X, 2020. Molecular and immunological characterizations of interleukin-11 in large yellow croaker (). Fish & Shellfish Immunology, 100: 9—17

Zwollo P, 2011. Dissecting teleost B cell differentiation using transcription factors. Developmental & Comparative Immunology, 35(9): 898—905

Zwollo P, Cole S, Bromage E, 2005. B cell heterogeneity in the teleost kidney: evidence for a maturation gradient from anterior to posterior kidney. Journal of Immunology, 174(11): 6608—6616

COMPARATIVE TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF THE HEAD KIDNEY AND TRUNK KIDNEY IN ADULT YELLOW CATFISH ()

ZHONG Ai-Hua, DAI Xiao-Xin

(College of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

The immune system of teleost is unique because the head kidney and trunk kidney are the sites for hematopoiesis and immune response. To explore the differences of hematopoiesis and immune function between head kidney and trunk kidney, the transcriptomes of head kidney and trunk kidney of yellow catfishwere sequenced through high-throughput sequencing technology. After trimming and filtering, clean reads were assembled into 59 979 transcripts with N50 value of 3 919 bp. A total of 24 487 Unigenes were annotated in five databases (GO, KEGG, NR, Pfam and Swissprot). Gene expression profile in the head kidney and trunk kidney were analyzed, and 3 949 differentially expressed genes (DEGs) were found. Among the DEGs, 1 112 genes were highly expressed in head kidney, including KIT ligand, Early B cell factor 1, Toll-like receptor 1, Toll-like receptor 2 etc. In total, 3 527 genes were highly expressed in trunk kidney, including C-C motif chemokine19, C-C motif chemokine 25, complement C5, C9, interleukin 17 receptor C, RIG-I, interleukin 27, etc. Some immune-related genes were expressed in trunk kidney only, such as encoded gene of immunoglobulin heavy chain and light chain. The results show that hematopoiesis and immune function between head and trunk kidney are different from each other. This study will help explore the immune defense mechanism of yellow catfish and other teleosts.

yellow catfish; head kidney; trunk kidney; RNA sequencing

* 浙江省“水產(chǎn)”一流學(xué)科開放課題, 11034060216號; 浙江省教育廳項(xiàng)目, Y202044632號。鐘愛華, E-mail: zhongpe@ zjou.edu.cn

2021-05-01,

2021-06-03

S917.4

10.11693/hyhz20210500110