長牡蠣(Crassostrea gigas)黑色殼表面微生物多樣性的研究*

李玲玲 謝超伊 宋宏策 陳 熙 劉文娟 黃寶玉 張美溦 劉雅瓊 魏 磊 王曉通

長牡蠣()黑色殼表面微生物多樣性的研究*

李玲玲 謝超伊 宋宏策 陳 熙 劉文娟 黃寶玉 張美溦 劉雅瓊 魏 磊①王曉通①

(魯東大學農學院 煙臺 264025)

為探究自然海區與室內養殖環境對軟體動物殼色及殼表面細菌群落多樣性的影響, 以黑色殼長牡蠣()為研究對象, 在自然海區與室內環境分別暫養30 d后, 對長牡蠣的殼色及殼表面細菌群落的多樣性和差異細菌功能進行分析。結果表明, 室內養殖的黑殼長牡蠣出現較為明顯的殼褪色現象, 其黑色素含量顯著下降, 遠低于自然海區養殖的黑殼長牡蠣。16S rRNA基因測序結果顯示, 變形桿菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌(Cyanobacteria)為長牡蠣殼表面的主要優勢菌, 其中變形桿菌的豐度超過50%。在門水平上, 放線菌(Actinobacteria)、儉菌超門(Parcubateria)和Bacterial rice cluster 1(BRC1)在室內、外養殖長牡蠣之間存在較為顯著的差異(<0.05), 而具有降解作用的放線菌和儉菌超門細菌在室內養殖的黑殼長牡蠣殼表面豐度較高。在屬水平上, 兩組之間存在顯著差異的細菌共計67種。該研究揭示了不同生境條件下, 黑殼長牡蠣殼表面的微生物群落物種組成及差異, 為解析長牡蠣殼色的形成機制提供了新的分析視角。

長牡蠣(); 細菌群落; 高通量測序; 黑色素; 殼色

顏色多態性是指在自然環境中, 一個物種的不同或同一群體中不同個體呈現出兩種或兩種以上可遺傳的分離且不連續的顏色表型(Mckinnon, 2010)。貝殼顏色的不同會影響消費者的選擇, 日常生活中, 消費者更傾向于購買顏色鮮艷的海產品(Brake, 2004)。研究發現, 貝殼顏色的不同對軟體動物的生長、繁殖、抗氧化等多個方面都會產生影響(Adzigbli, 2020)。Ge等(2015)發現, 紫殼長牡蠣家系的存活率顯著高于其他殼色。近年來, 隨著軟體動物選擇育種研究的發展, 貝殼顏色作為一種重要的性狀被廣泛應用于多種軟體動物的選育, 例如: 長牡蠣(), 蝦夷扇貝()(Sun, 2015)、三角帆蚌()(Chen, 2017), 其中長牡蠣已被成功選育出黑殼、紫殼、橙殼、金殼和白殼等多種殼色的新品系(Zhu, 2018)。

軟體動物的殼色通常是因不同色素沉積所形成, 例如: 吡咯、黑色素、卟啉、膽汁素、類胡蘿卜素等, 其中黑色素的分布最為廣泛(Stemmer, 2014; Williams, 2017; Liu, 2020)。黑色素可以保護生物免受寄生蟲、污染物、低溫、氧化應激和紫外線的影響, 參與器官的發育調控, 具有極為重要的作用(Dubey, 2014)。黑殼長牡蠣不僅外殼黑, 其外套膜及閉殼肌痕均呈現黑色, 富含黑色素, 具有較高的價值。研究表明, 高濃度雙酚A (Bisphenol A, BPA)暴露后, 富含黑色素的黑殼長牡蠣組織未出現較為明顯的病理變化, 表明黑殼長牡蠣與白殼長牡蠣相比可能具有更強的免疫力(姜秋云, 2019)。

微生物在動物的生存、生長代謝、營養物質吸收等過程中發揮著重要的作用(Bang, 2018)。隨著高通量測序技術的發展, 越來越多的研究采用高通量測序的方法從種群結構、進化關系、群落多樣性與環境之間的協作關系等多個方面對微生物進行研究。King等(2012)首次利用16S rRNA基因測序技術對美洲牡蠣()腸道和消化腺內的微生物種群組成進行探究。目前高通量測序技術在雙殼貝類微生物多樣性研究的應用主要集中在不同環境軟體動物各組織微生物群落組成情況及差異細菌的作用分析(Madigan, 2014; Dubé, 2019; Horodesky, 2020); 致病菌對軟體動物生長發育的影響等方面(Labare, 1990; Stevick, 2019)。對雙殼貝類殼表面微生物的研究相對較少。已有的研究表明, 變形桿菌是雙殼貝類殼表面的主要優勢細菌, 美洲牡蠣殼表面微生物群落主要由α變形桿菌(Alphaproteobacteria)組成, 而加州貽貝()殼表面微生物則以γ變形桿菌(Gammaproteobacteria)為主(Pfister, 2014; Arfken, 2017)。

在黑殼長牡蠣的繁育過程中發現, 成體長牡蠣(殼長10—12 cm左右)經過約30 d室內養殖后, 其外殼表面顏色會變淺, 失去光澤, 出現殼褪色現象。在自然海區中養殖的黑殼長牡蠣則未發生外殼褪色的現象(圖1)。一般而言, 不同的海區、不同的季節海洋水體理化性質具有較大的差異, 水體中微生物組成和豐度隨季節等因素的變化有所改變(Wang, 2020)。受水環境的影響, 長牡蠣殼表面微生物組成上可能存在較大的差異。本研究以海區正常養殖及發生褪色現象的黑殼長牡蠣的殼表面微生物為研究對象, 對殼表面微生物的16S rRNA基因V3—V4區進行擴增并測序, 比較其微生物群落組成上的差異。從微生物多樣性的角度, 探究了長牡蠣殼色的維持機制及褪色現象發生的原因。

圖1 黑殼與褪色黑殼長牡蠣

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用黑殼長牡蠣均來自于山東省長島縣南長山島連城灣海區養殖的個體選育家系。選取12只殼長(10—12 cm)、殼寬(4—6 cm)、殼高(2—3 cm)無顯著差異的個體作為實驗對象。隨機挑選其中6只黑殼長牡蠣轉入室內養殖實驗室, 使用50 L玻璃缸養殖, 定時投喂密度為5.0×105個/mL的優質金藻, 喂食后3 h內換水一次, 養殖用海水取自山東省煙臺市周邊海區; 另外6只則繼續在南長山島海區中吊籠養殖。養殖期間, 自然海區及室內環境的鹽度、溫度及pH如表1所示。養殖30 d后, 分別對自然海區養殖未褪色黑殼長牡蠣樣本(B組), 實驗室內養殖褪色黑殼長牡蠣樣本(F組)外殼表面微生物進行取樣。取樣時, 使用消毒棉簽蘸取牡蠣殼表面的微生物, 隨即將棉簽保存至2 mL的凍存管中, 置于-80 °C低溫冰箱保存。

表1 水環境基礎指標

Tab.1 Basic indicators of water environment

1.2 殼色差異分析

利用Image-Pro Plus圖像分析軟件對實驗所用黑殼長牡蠣外殼的光密度值(optical density values, ODV)進行測量, 用以表征殼表面的顏色變化。將長牡蠣外殼清洗干凈后, 使用數碼相機拍攝牡蠣殼照片。拍照時, 在相機的兩邊放置同等功率的日光燈, 以去除陰影的影響。測量/計數/尺寸/比例調節器設置為牡蠣殼的輪廓, 選定測定區域, 進行光密度的測定。強度校準設定為標準光密度, 灰度值轉換為光密度值(ODV), 范圍從0 (完全白色)到2.0 (完全黑色)。

1.3 DNA的抽提與PCR擴增測序

使用DNeasy?Power Water?Kit試劑盒(QIAGEN)進行基因組DNA的提取, 利用1%的瓊脂凝膠電泳對基因組DNA的質量進行檢測。16S rRNA V3-V4區的PCR擴增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)。反應程序: 95 °C 30 min; 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 45 s, 27個循環; 72 °C 10 min。PCR反應體系如表2所示。

表2 PCR反應體系

Tab.2 PCR reaction system

利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物的質量, 使用AxyPrep DNA膠回收試劑盒(Axygen Biosciences)切膠回收PCR產物, 最后使用Illumina MiSeq PE2500測序平臺進行測序。

1.4 16S rRNA基因測序數據分析

為減少干擾數據的存在, 對原始測序數據進行如下的預處理: (1) 數據質控與優化統計, 使用Prinseq軟件對測序數據質量進行控制, 去除序列長度小于50 bp的短片段和低復雜度序列。使用FLASH軟件對測序數據進行拼接。(2) 去除嵌合體及靶區域外序列, 采用Mothur軟件進行測序錯誤的矯正及去除嵌合體的操作。(3) 操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)注釋, 提取優化序列的非重復序列, 按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行聚類。(4) 分類學注釋, 利用Silva數據庫(https:// www.arb-silva.de/版本號: 132)進行16S rRNA基因的比對。使用RDP classifier數據庫(http://rdp.cme. msu.edu/misc/resources.jsp)進行物種分類學分析, 統計在各分類水平下微生物群落的組成情況。

預處理完成后, 進行如下的統計分析: (1) 使用Mothur軟件對微生物群落進行Alpha多樣性分析。使用Shannon指數繪制稀疏曲線, 以反映測序量的合理性。(2) 使用Qiime軟件進行Beta多樣性分析。(3) 利用Wilcox秩和檢驗(Wilcoxon rank-sum test)進行組間顯著性差異檢驗, 使用FDR (false discovery rate)對值進行校正。(4) 利用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)篩選出在兩組之間存在顯著性差異, 具有生物學意義的物種, 并估算每個物種所產生的影響。比較策略選擇all-against -all。(5) 基于皮爾遜相關系數分析環境因素與殼表面微生物群落之間的關系。

2 結果

2.1 殼色變化分析

ODV值的大小可間接反映黑殼表面的色素變化情況, 測定結果如圖2所示。B組長牡蠣外殼表面的平均ODV值為0.68, F組長牡蠣外殼表面的平均ODV值為0.34, B組平均ODV值是F組的2倍, 兩組樣本平均ODV值存在極顯著的差異(<0.01)。相比于自然海區養殖的長牡蠣, 室內養殖的長牡蠣外殼顏色變淺, 出現較為明顯的褪色現象。

圖2 灰度對比確定殼體色素沉積的平均光密度值(ODV)

注: **表示兩組之間存在極顯著差異(<0.01)

2.2 細菌群落Alpha多樣性分析

測序結果顯示, 有效序列數目在43 782—52 116之間, 序列平均長度為417.20 bp。本次測序共獲得的4 728個OTU, 涵蓋43個門, 99個綱, 199個目, 362個科、665個屬, 1 271個種。兩組樣本的平均覆蓋度(Coverage)均在98%以上, Coverage指數接近于1, 測序深度基本覆蓋樣本中的所有物種。Alpha多樣性指數可反映微生物群落的豐富度與均勻度, 常使用Shannon指數、Simpson指數、ACE指數和Chao指數的大小表征。結果顯示: B組的Shannon指數、ACE指數和Chao指數略高于F組, 而F組Simpson指數更高(表3)。Wilcoxon秩和檢驗顯示, 兩組樣本的各Alpha多樣性指數之間無顯著性差異。稀疏曲線顯示, 隨著測序數據量的增加, 曲線逐漸趨于平緩, 當測序數據量在10 000時, 測序數據達到飽和(圖3)。上述分析結果表明, 兩組長牡蠣殼表面微生物群落物種組成較為豐富, 微生物群落的豐富度、均勻度均較高。

表3 細菌群落Alpha多樣性指數

Tab.3 The alpha diversity index of bacterial communities

圖3 16S rRNA基因測序稀疏曲線

2.3 Beta多樣性分析

在OTU水平上, 基于Bray-Curtis距離算法, 利用非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)反映細菌群落的Beta多樣性。NMDS分析結果顯示, 組內各個樣本點分布區域比較密集, 微生物群落結構相似, 差異較小(圖4)。B組和F組的細菌形成了兩個不同的群落空間結構, Beta多樣性存在顯著差異(Stress=0.124,<0.01)。使用相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM), 探究兩組樣本間的微生物群落組成的差異性。ANOSIM分析結果表明, 兩組樣本的組間差異明顯大于組內差異, 兩組間的微生物群落結構差異顯著(=0.307,<0.05)。上述分析結果顯示, B組與F組之間的微生物群落分布差異較大, 而分組內的樣本差異較小。

圖4 非度量多維尺度分析(NMDS)

注: 圖中每個點代表一個樣品, 點與點之間的距離表示樣品間物種組成差異程度, 同一顏色表示同一組的樣品。紫色圓點為黑殼(B組), 橙色三角為褪色黑殼(F組)

2.4 微生物群落結構組成分析

Venn圖可以直觀的反映兩組樣本細菌群落OTU組成的差異性和重疊關系。兩組樣本微生物共有OTU數目為3 456 (圖5)。在B組中, OTU的數目共計4 130, 獨有OTU的數目674, 獨有OTU占B組OTU總數的16.32%。獨有OTU多隸屬于酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、儉菌超門(Parcubateria)等。在F組中, OTU數目共計4 054, 獨有OTU的數目為598, 獨有OTU占F組OTU總數的14.75%。F組獨有OTU多隸屬于變形桿菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Latescibacteria菌及浮霉菌門(Planctomycetes)等。從微生物的組成上看, 兩組之間獨有的OTU數目相對較少, 所占比例較小, 但分類較為豐富, 隸屬于多個細菌門類。

圖5 Venn圖分析結果

對長牡蠣殼表面的微生物群落組成分析, 主要在門(phylum)和屬(genus)兩個分類學水平上展開。門水平上, 微生物群落主要由10個細菌門組成, 各樣本中細菌豐度的差異如圖6a所示。變形桿菌是主要的優勢菌, 在兩組樣本中的豐度超過50.00%, 且以α變形桿菌的紅桿菌科(Rhodobacteraceae)為主。擬桿菌門為第二優勢菌, 在B組和F組中的豐度分別為19.70%和20.20%。其他優勢菌如: 藍細菌(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)及浮霉菌門(Planctomycetes)等, 在樣本中的豐度均超過1.00%, 但豐度較低(表4)。

圖6 門水平(a)和屬水平(b)上各樣本細菌群落結構組成

表4 門水平優勢菌的豐度

Tab.4 Abundance of phylum level dominant species

屬水平上, 豐度排名為前25的細菌豐度差異結果如圖6b所示。的豐度超過7.00%, 是主要的優勢細菌。屬水平上, 兩組中豐度均超過1.00%的細菌有4種隸屬于變形桿菌門, 它們分別是:、、和, 其中的豐度超過4.00%。細菌在兩組樣本中的豐度僅次于和(表5)。

表5 屬水平優勢菌的豐度

Tab.5 Abundance of dominant species at genus level

續表

2.5 組間差異顯著性檢驗

Wilcox秩和檢驗結果顯示: 放線菌門、儉菌超門和Bacterial rice cluster 1 (BRC1)在兩組之間存在較為顯著的差異(<0.05)。放線菌門和儉菌超門的細菌在F組的豐度極顯著高于B組的豐度(<0.01), 且放線菌門和儉菌超門細菌的豐度之間存在極顯著的相關性(< 0.01)。而BRC1菌則在B組的豐度(0.03%)顯著高于F組(0.01%)(<0.05)。皮爾遜相關分析表明, 放線菌門、儉菌超門細菌的豐度與黑色素含量之間存在顯著的負相關性(<0.05), BRC1細菌的豐度與黑色素的含量無明顯的相關性。

屬水平上, 67個屬在兩組間存在顯著性差異(<0.05), 其中有19個屬在兩組間存在極顯著性差異(<0.01)。如圖7所示, 屬水平上, 平均豐度處于前25的細菌, 有7種在兩組之間存在顯著差異, 其中、、、、在F組中豐度較高, 與B組存在較大差異。B組中, 玫瑰變色菌屬()、的豐度較高, 與F組存在顯著差異(<0.05)。除此之外, 科爾維爾氏菌屬()在B組的豐度顯著高于F組, 其相對豐度僅次于。、和細菌豐度與長牡蠣黑色素含量之間存在顯著的負相關關系(<0.05)。其他幾種差異細菌的豐度與長牡蠣黑色素含量之間無顯著的相關性。在兩組中, 存在顯著差異的細菌屬多隸屬于變形桿菌門、放線菌門、浮霉菌門及擬桿菌門等, 變形桿菌門是豐度最高的細菌。在兩組樣本中豐度較高的物種, 比如:菌、和則在兩組樣本中不存在顯著性差異。

圖7 兩組樣本差異分析

注: **表示兩組之間存在極顯著差異(< 0.01), *表示兩組之間存在顯著差異(< 0.05)

LDA分布柱狀圖表明: 當LDA閾值設定為3.00時, 兩組樣本間共有17個物種的豐度存在顯著差異(<0.05)(圖8)。B組中、科爾維爾氏菌屬、玫瑰變色菌屬和等細菌分值較高, 其中的LDA分值最大(LDA=3.75), 產生的影響較大。F組的、、、等細菌的分值較高, 與B組存在顯著差異(<0.05),是LDA分值最大的細菌(LDA=3.88)。

圖8 LDA分布柱狀圖

2.6 環境因素對微生物群落的影響

利用皮爾遜相關系數反映微生物群落與水體環境之間的正負相關性。如圖9所示: 屬水平上, 相對豐度在前25的細菌中, 有5種細菌豐度與水體環境之間存在相關性。、、、、與鹽度和溫度之間存在顯著的正相關, 與pH之間存在顯著的負相關(<0.05)。而與pH之間存在顯著的正相關, 與鹽度和溫度則呈現負相關關系(<0.05)。

3 討論

研究表明, 外殼表面沉積不同種類的色素使貝類呈現出多彩的顏色。外殼表面黑色素的沉積使長牡蠣呈現黑色(Williams, 2017)。本實驗所用長牡蠣富含黑色素, 不僅外殼黑, 外套膜和閉殼肌痕均呈現黑色。目前, 對于長牡蠣黑色素的發生機制尚未有明確的結論。Yu等(2017)的研究表明, 視黃醛脫氫酶、酪氨酸酶和細胞色素P450等基因家族可能在長牡蠣黑色素沉積過程中發揮重要作用。

已有對長牡蠣微生物群落的研究多集中在不同組織之間。在長牡蠣鰓、外套膜和血淋巴中, 變形桿菌為主要優勢細菌; 而消化腺中變形桿菌、擬桿菌及放線菌的豐度較高(Fernández, 2014; Lokmer, 2016)。針對牡蠣殼表面微生物的研究相對較少。例如: Arfken等(2017)發現, 美國大西洋沿岸的美洲牡蠣()殼表面微生物群落組成主要以α變形桿菌中的鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)、Erythrobacteraceae科和紅桿菌科(Rhodobacteraceae)為主。在韓國沿海廢棄牡蠣殼表面, 變形桿菌所占比例達到了41%, 其次為擬桿菌(36.4%), 厚壁菌(Firmicutes)所占比例不足10%(Math, 2010)。本研究顯示, 兩種不同環境中的長牡蠣殼表面的主要優勢菌同樣為變形桿菌門, 其豐度超過50%, 以α變形桿菌為主。變形桿菌是海洋細菌中最重要的類群, α變形桿菌占海洋微生物總數的10%左右(Park, 2014; 張作峰等, 2020)。并且山東煙臺周邊海域海洋水體中α變形桿菌亦是第一優勢菌(張艷, 2010)。因此, 長牡蠣所處水體環境與殼表面優勢細菌的組成具有極大的相似性。

圖9 水體性質與微生物群落之間的相關性

注: **表示兩組之間存在極顯著差異(< 0.01), *表示兩組之間存在顯著差異表示(< 0.05)

進一步的分析顯示, 在微生物群落的組成上, 兩種水體環境中長牡蠣殼表面的微生物群落組成上存在一定差異。門水平上, BRC1細菌在B組的豐度遠高于F組, 而放線菌門和儉菌超門在F組的豐度更高。

BRC1細菌廣泛存在于富含有機物的環境中(Kadnikov, 2019), 目前尚未成功培養出BRC1細菌門的菌株, BRC1細菌的具體功能尚不清晰, 仍需進一步的研究。在F組中, 放線菌所占比例達到了6.14%, 約是B組的兩倍。放線菌廣泛存在于各種環境中, 具有強大的生物合成潛力, 能夠產生具有較強抗菌活性的次級代謝產物。放線菌還具有降解有機物的作用, 其產生的水解酶可降解各種生物聚合物, 例如: 纖維素、木聚糖和幾丁質, 在氮碳循環過程中發揮著重要的作用(Manivasagan, 2013; Fernández, 2014)。除放線菌外, 在F組的長牡蠣殼表面發現, 儉菌超門的豐度(2.19%)高于B組(1.20%)。儉菌超門細菌的基因組幾乎都在1 Mb以下, 缺乏能量代謝的關鍵基因。因此, 儉菌超門細菌無法單獨生活, 需要與其他微生物共生生活, 例如放線菌等(Nelson, 2015)。相關性分析結果表明, 儉菌超門與放線菌的豐度存在極顯著的相關性(<0.01)。儉菌超門的部分細菌同樣具有降解功能, 可以降解環境中的纖維素和甲殼素(Nelson, 2015; 陶曄等, 2020)。長牡蠣殼中的黑色素不溶于水, 與蛋白質、多糖等生物聚合物結合緊密(何成等, 2017)。F組中, 放線菌和儉菌超門細菌的大量聚集可能促進了長牡蠣殼表面生物聚合物的降解過程, 從而發生了殼褪色現象。

門水平上, 存在顯著差異的細菌的數目較少, 多數細菌的豐度無較大的差異。屬水平上, 差異細菌的數目較多, 超過50個屬在兩組之間存在顯著的差異。相比于F組, 玫瑰桿菌屬、科爾維爾氏菌屬和在B組長牡蠣黑殼表面的豐度均較高。

玫瑰桿菌屬廣泛存在于各種海洋介質中, 比如海水、沉積物、海冰等。玫瑰桿菌屬通過脫甲基途徑和裂解途徑將海洋中的有機硫化物二甲基疏基丙酸內鹽(Dimethylsulfoniopropionate, DMSP)代謝分解, 參與硫循環(Sun, 2016)。在本次測序中, 玫瑰桿菌屬在B組的豐度為1.64%, 高于F組的1.00%。推測其可能的原因是水體環境的不同造成細菌豐度的差異?？茽柧S爾氏菌屬是嗜冷菌, 在海冰、極地沉積物、深海海溝中均有發現(Nogi, 2004)?？茽柧S爾氏菌屬具有降解碳氫化合物的作用, 在溢油環境中, 可大量檢出(Gutierrez, 2013; Mason, 2014)與科爾維爾氏菌的作用相似, 同樣具有降解碳氫化合物的作用。富含碳氫化合物的沉積物中菌的豐度和多樣性都會升高(Guibert, 2012; Hestetun, 2015)。

在南長山島養殖的黑殼長牡蠣殼表面, 科爾維爾氏菌和的豐度均高于室內養殖的長牡蠣?？赡苁怯捎谕庠此w的排放, 導致渤海灣水體中的碳氫化合物含量較高, 促進了具有降解功能細菌的繁殖, 例如科爾維爾氏菌和。因此, 水體環境可能對細菌的豐度產生較大的影響。然而, 由于科爾維爾氏菌屬和屬細菌難以獨立培養, 在長牡蠣殼色維持方面所起到的作用尚不明確, 仍需進一步的探索。

微生物群落的組成是動態的, 受地理環境的影響較大, 隨鹽度、溫度、pH值等環境因素的變化而變化(Prieur, 1990; Harris, 1993; Jing, 2019)。自然海區養殖的長牡蠣生活環境復雜多變, 在潮汐、波浪等風力或水力的作用下, 水體不斷混合, 水體微生物處于不斷的變化之中。皮爾遜相關性分析結果表明, 在兩組樣本中存在顯著差異細菌的豐度與水體環境之間存在較強的相關性。其中、、、、細菌的豐度與鹽度和溫度之間存在顯著的正相關關系, 與pH之間存在顯著的負相關關系(<0.05)。而細菌的豐度與pH之間存在顯著的正相關關系, 與鹽度和溫度則呈現顯著的負相關關系(< 0.05)。因此, 環境條件與微生物豐度之間相關性較強, 并可影響微生物的豐度。

4 結論

與自然海區相比, 室內養殖的長牡蠣發生了殼褪色現象, 且黑色素含量顯著下降。殼表面微生物多樣性分析表明, 兩種環境中養殖的長牡蠣微生物群落在種類組成上無較大的差異, 但是細菌的豐度有所不同。變形桿菌門是長牡蠣殼表面微生物群落的主要優勢菌, 其豐度在兩組中超過50%。褪色黑殼長牡蠣表面具有降解作用的細菌豐度較高, 例如放線菌門和儉菌超門, 推測其可能參與長牡蠣殼褪色過程, 環境條件的不同可影響長牡蠣殼表面細菌的豐度。本研究從微生物多樣性的角度, 解析了黑殼長牡蠣殼表面褪色現象的可能原因。

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MICROBIAL DIVERSITY ON SURFACE OF BLACK-SHELL

LI Ling-Ling, XIE Chao-Yi, SONG Hong-Ce, CHEN Xi, LIU Wen-Juan, HUANG Bao-Yu, ZHANG Mei-Wei, LIU Ya-Qiong, WEI Lei, WANG Xiao-Tong

(School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, China)

To explore the effects of natural water and indoor environment on the shell color and bacterial community diversity of molluscs, the melanin-richwas cultured in the natural water and indoor environment for 30 days. The diversity of bacterial community structure and the function of different bacteria on the shell color and shell surface of thewas analyzed. Results show that the black-shelledcultured indoor showed obvious shell fading phenomenon and the melanin content was significantly decreased, which was much lower than the black-shelledcultured in natural water. 16S rRNA gene sequencing showed that Proteobacteria, Bacteroidetes, and Cyanobacteria were the main dominant bacteria on the surface ofshells and the abundance of Proteobacteria exceeded 50%. At the phylum level, Actinobacteria, Parcubateria, and Bacterial rice cluster 1 (BRC1) were significantly different between the two groups (< 0.05). Among them, the Actinobacteria and Parcubateria bacteria with degrading effect was relatively high in the surface abundance of the black-shelledgrown indoor. At the genus level, there were 67 species of bacteria with significant differences between the two groups. This study revealed the species composition and differences of the microbial community on surface of oyster shell under different habitat conditions, and provided a new analytical perspective for the oyster shell color manipulation.

; bacterial community; high-throughput sequencing; melanin; shell color

* 國家自然科學基金項目, 41906088號; 國家自然科學基金項目, 41876193號; 山東省高等學校“青創科技計劃”, 2019KJF004號; 山東省貝類產業技術體系, SDAIT-14號。李玲玲, 碩士研究生, E-mail: lilingling0603@126.com; 并列第一作者: 謝超伊, 碩士研究生, E-mail: 2433040312@qq.com

魏 磊, 副教授, E-mail: lei819@126.com; 王曉通, 教授, E-mail: wangxiaotong999@163.com

2021-04-06,

2021-06-08

S917

10.11693/hyhz20210400082