利拉魯肽可能通過AMPK通路減輕2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠的脂質(zhì)代謝

朱宏偉，李華，郝芳，劉文軍，李志輝

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古包頭 014030；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，內(nèi)蒙古包頭 014030；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 醫(yī)務(wù)部，內(nèi)蒙古包頭 014030

糖尿病（DM）是一種常見的代謝性疾病，其中50%~70%的DM患者為2型糖尿?。═2DM），而T2DM患者更容易合并脂肪肝[1-3]。非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）與DM、肥胖和血脂異常等代謝因素密切相關(guān)。DM促進(jìn)NAFLD從過度的肝脂肪沉積向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化甚至肝癌發(fā)展，增加了肝臟相關(guān)疾病的病死率[4-5]。T2DM的特點(diǎn)是胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞病變，導(dǎo)致血糖控制惡化。如果DM藥物或基礎(chǔ)胰島素?zé)o法控制機(jī)體血糖，需注射一定量的胰島素。但在大多數(shù)情況下，由于胰島素劑量不當(dāng)導(dǎo)致機(jī)體血糖紊亂和體質(zhì)量增加，使脂肪肝進(jìn)一步惡化。T2DM患者NAFLD的緩解較困難。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種腸促激素，由腸細(xì)胞分泌。GLP-1在哺乳動(dòng)物中具有多種功能，包括促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素釋放，減緩胃排空，減少胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取[6-9]。GLP-1激動(dòng)劑艾塞那肽、利拉魯肽等作為一類新型的降糖藥物，已在臨床上應(yīng)用于T2DM的治療。GLP-1激動(dòng)劑和基礎(chǔ)胰島素聯(lián)合治療可協(xié)同降低血糖水平，減少餐后血糖水平。但大多數(shù)結(jié)論來自臨床試驗(yàn)，其潛在機(jī)制仍然未知。報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究動(dòng)物

KK/upj-ay/J小鼠（以下簡(jiǎn)稱為KKay小鼠）雄性60只，SPF級(jí)，10～12周齡，體質(zhì)量28～35 g，隨機(jī)分為普通飲食20只，高脂飲食40只，連續(xù)飼養(yǎng)4周，4周后每周檢測(cè)血糖水平，以確定造模是否成功。KKay小鼠由北京聯(lián)合利華提供。

1.2 血糖水平檢測(cè)

尾靜脈采少量血，置于血糖儀（羅氏血糖儀，貨號(hào)：KDLSZYSZ001），收集數(shù)據(jù)。

1.3 血液生化分析

尾靜脈采少量血，置于血糖儀空腹過夜后，左心室穿刺采集血樣，室溫靜置3 h后，以3 000 r/min離心10 min。總蛋固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、采用Cobas Integra 400 Plus全自動(dòng)生化分析儀（Roche Diagnostics,瑞士）測(cè)定。

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

蛋白質(zhì)印跡分析以研究肝臟組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)及其磷酸化水平。將肝臟組織研磨成液體用RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解。每組提取的蛋白通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合，然后用特異性一抗孵育過夜?？笰MPK和抗p-AMPK購自Santa Cruz（Biotechnology,Santa Cruz,CA,United States）。采用Perkinelmer western lightning Plus-ECL檢測(cè)特異性條帶。使用Quantity One軟件（Bio-Rad,Hercules，美國）對(duì)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行密度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSSVersion19.0（SPSS，Chicago，IL，美國）分析數(shù)據(jù)，組間比較采用t檢驗(yàn)和單向ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM合并NAFLD小鼠模型的建立

KKay小鼠高脂飲食4周后，檢測(cè)正常飲食組和高脂飲食組小鼠血糖水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂組小鼠血糖水平均>13.8 mmol/L（前一天饑餓行血糖檢測(cè)），血清TC≥6.2 mmol/L，TG≥4.1 mmol/L，見圖1。

圖1 高脂飲食4周促進(jìn)KKay小鼠血糖、總膽固醇和三酰甘油水平上調(diào)

2.2 利拉魯肽改善KKay DM脂肪小鼠的血糖

為了證實(shí)利拉魯肽對(duì)血糖控制的影響，用利拉魯肽治療T2DMKKay小鼠。利拉魯肽治療12周后，檢測(cè)各組小鼠的血糖水平，利拉魯肽組小鼠的血糖明顯低于未治療組，見圖2。

圖2 利拉魯肽改善小鼠血糖濃度

2.3 利拉魯肽緩解體內(nèi)血脂代謝

利拉魯肽治療12周后，進(jìn)一步檢測(cè)KKay小鼠血脂，包括TC、TG、LDL-C和HDL-C。結(jié)果顯示利拉魯肽顯著降低了KKay小鼠的TC、TG和LDL-C水平，輕微降低HDL-C水平，見圖3。

圖3 利拉魯肽改善了小鼠體內(nèi)血脂的代謝

2.4 AMPK信號(hào)通路可能參與利拉魯肽調(diào)節(jié)的脂質(zhì)代謝和血糖改變

在體內(nèi)AMPK通路參與利拉魯肽介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。利拉魯肽治療的KKay小鼠肝組織中AMPK信號(hào)通路被激活，見圖4。

圖4 蛋白印跡顯示利拉魯肽激活A(yù)MPK信號(hào)通路

3 討論

NAFLD是世界范圍內(nèi)常見的肝病，包括NAFL和NASH。脂肪肝可能不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重肝功能紊亂。但脂肪性肝炎合并炎癥和纖維化可發(fā)展為肝損害并伴有許多并發(fā)癥[10]。越來越多的證據(jù)表明，T2DM與NAFLD密切相關(guān)。在NAFL和NASH患者中，分別有23%和47%被確診為T2DM[11]。目前還未見有針對(duì)NAFLD有效的治療藥物，因此NAFLD合并T2DM的患者治療策略更是甚微。GLP-1激動(dòng)劑作為一種新型的抗DM藥物可以緩解肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累和炎癥[12]。然而，其潛在機(jī)制尚未完全了解。利拉魯肽與天然GLP-1具有97%的同源性，可以成功延長GLP-1活性，抑制DPP4活性，限制腎臟清除率[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，除降低血糖外，利拉魯肽對(duì)骨、心、腎、肝等不同器官具有保護(hù)作用[14]。猜想利拉魯肽可能緩解NAFLD合并T2DM患者血糖和血脂的代謝。結(jié)果表明，利拉魯肽能顯著降低血糖和血脂的同時(shí)，可以激活A(yù)MPK通路。盡管利拉魯肽在減輕肝脂肪堆積方面的作用一直存在爭(zhēng)議，但該研究結(jié)論與最近的一篇報(bào)道相似，該報(bào)道稱，利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍顯著降低了T2DM和NAFLD患者的體質(zhì)量、肝內(nèi)脂質(zhì)和內(nèi)臟脂肪組織[15]。

臨床上，利拉魯肽可以減輕體質(zhì)量和肝臟脂肪堆積[16]。然而，對(duì)其機(jī)制的研究仍十分有限。文獻(xiàn)報(bào)道AMPK信號(hào)通路也參與利拉魯肽刺激的肝臟和脂肪組織的脂肪降解[17]。DPP4抑制劑可以抑制內(nèi)源性GLP-1的降解，刺激AMPK的激活和脂肪細(xì)胞的脂肪變性[18]。在目前的研究中，發(fā)現(xiàn)AMPK信號(hào)通路可能參與利拉魯肽調(diào)控的肝臟相關(guān)代謝以及血脂水平。