非洲豬瘟病毒檢測技術概述

張皖靜,張 琪,張曉霞,吳文靜,楊 丹,袁文天,許 燕*,趙 凱

(1 上海師范大學生命科學學院,上海 200234;2 上海博滿生物科技有限公司,上海 201106;3上海市農業科學院生物技術研究所,上海 201106 )

非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)被我國列為A 類重點防范傳染病。 起初,非洲豬瘟發生在非洲國家肯尼亞,因此命名為非洲豬瘟,并傳播到西歐國家。 2017 年3 月,在俄羅斯遠東地區發現了非洲豬瘟;2018 年8 月3 日,中國確診首個非洲豬瘟病例。 非洲豬瘟可以通過血液、糞便、分泌物、尿液、淚液、傷口和空氣傳播,呈流行性發生時,病毒迅速蔓延。 病豬的臨床表現是體溫迅速升高、呼吸急促、呼吸困難、嘔吐、死亡等癥狀。 我國是生豬和豬肉的主要生產和消費國,由于尚未研制出預防非洲豬瘟的有效疫苗,非洲豬瘟病毒的檢測技術研究迫在眉睫。

非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)屬于DNA 病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬成員,也是這個家族唯一的成員。 非洲豬瘟病毒是一條雙鏈DNA 分子,基因組全長約為170—190 kb,含有151 個開放閱讀框(ORFs),以非洲豬瘟病毒為模板,可以編碼150—200 種蛋白,如p72 蛋白。 其中p72蛋白是最重要的結構蛋白之一,在非洲豬瘟病毒檢測中經常用作非洲豬瘟的血清學診斷。 歐洲毒株基因(即格魯吉亞2007∕1 株)與報道的中國遼寧省沈陽市沈北新區某養殖場發生的非洲豬瘟病毒序列完全匹配,可以此為靶序列構建非洲豬瘟病毒質粒作為核酸檢測的陽性對照。 目前非洲豬瘟病毒的檢測主要分為免疫學檢測方法和核酸檢測方法。

1 免疫學檢測方法

1.1 ELISA 檢測(酶聯免疫吸附試驗)

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的基本原理是將特異性反應系統、間接放大系統和顯示系統結合起來,該方法在檢測抗體和抗原方面發揮著重要的作用。 應用ELISA 法檢測非洲豬瘟病毒,可以在早期檢測出帶有非洲豬瘟的病豬,并及時予以隔離。 ELISA 法具有高靈敏度、可以大量檢測的優點,但也存在特異性不強、每個試劑盒的標準不均一的局限性。 2012 年,董志珍等[1]將克隆獲得的ASFV 蛋白對小鼠進行免疫獲得單克隆抗體,利用此單克隆抗體建立了非洲豬瘟抗體的ELISA 檢測法,這種方法具有很強的特異性,比間接熒光法的靈敏度更高。 2016 年,曹琛福等[2]利用大腸桿菌轉化表達獲得了P54 蛋白,從而建立了非洲豬瘟病毒抗體競爭ELISA 方法,這種方法通過特異性檢測,與其他病毒均無交叉反應,特異性達100%,靈敏度達96.22%。

1.2 膠體金免疫層析(GICA)試紙條

膠體金是一種常見的標記技術。 它是一種以膠體金為示蹤劑標記的用于抗原抗體的免疫標記技術,具有獨特的優勢。 非洲豬瘟抗原涂在硝酸纖維素膜的檢測區域,將有膠體金標記的非洲豬瘟抗原附著于下部,形成免疫金標試紙條。 使用該試紙條建立用于檢測非洲豬瘟抗體水平的免疫金標記方法,優點在于試紙條不僅可以用于血清的檢測,也可以用于檢測全血樣品,操作簡便快速,結果準確率高、肉眼可直接判斷,適用于抗體檢測和現場樣本的大規模推廣;缺點在于需要獲得非洲豬瘟的抗原,但非洲豬瘟病毒變異性強,獲得有效的抗原有一定的難度。 2017 年,林彥星等[3]為了篩選出具有抗原性的非洲豬瘟病毒蛋白多肽,將牛血清蛋白(BSA)與利用非洲豬瘟病毒的VP73 蛋白合成的多肽進行偶聯,從而建立了非洲豬瘟病毒抗體的膠體金免疫層析檢測技術。 這種技術具有較強的特異性和穩定性,但不足之處在于靈敏度低,檢測結果需要根據臨床性狀和病史判斷,并且只能對死豬檢測,試驗結果還需要核酸檢測驗證。

2 分子生物學檢測方法

2.1 PCR 技術(聚合酶鏈式擴增)

PCR 技術是一種用于擴增特定DNA 片段的分子生物學技術。 模板可以是DNA 或者RNA,當模板是DNA 時,DNA 聚合酶從一小段雙鏈DNA 開始合成,互補序列與1 個或2 個合成寡核苷酸引物的單鏈DNA模板結合,一部分形成雙鏈結構。 基于PCR 的PCR 儀器實際上是一種溫度控制裝置,可以在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間進行控制。 用這種方法檢測非洲豬瘟病毒存在與否,優點在于方法簡單,不易污染,但也存在操作時間長,檢測一組非洲豬瘟病毒時間為2—3 h,且靈敏度較低,若模板拷貝數較低可能無法檢測出等缺點。 非洲豬瘟病毒中的B646L基因具有一段保守區,因此常常被用來設計引物檢測非洲豬瘟病毒的存在。 Basto 等[4]基于B646L基因設計了一對引物,以建立具有內部引物擴增片段243 bp和外部引物擴增片段370 bp 的ASFV 巢式PCR 方法。 該方法不僅可以檢測組織、血液樣本和培養物,還可以檢測攜帶ASFV 的昆蟲。 2008 年,Giammarioli 等[5]建立了多重PCR 方法用來檢測ASFV、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環病毒2 型(PCV-2)、豬細小病毒(PPV)和豬繁殖與呼吸障礙綜合病(PRRS),其中,對ASFV 檢測使用的引物就是使用世界動物衛生組織(OIE)推薦的保守區設計的引物。 但是,由于PCR 需要分析擴增產物,極微量的PCR 產物交叉污染可能導致假陽性;臨床上還可能存在酶抑制劑導致產物無法進行擴增,從而導致假陰性。

2.2 Real-time PCR 技術(實時熒光定量PCR)

實時熒光定量PCR(Real-Time Flurescent Quantitive Polymerase Chain Reaction)是運用具有特異性的熒光探針技術,將試驗操作時間控制在數小時內。 設計多對引物,并且同時進行多組熒光定量PCR,可以用來檢測非洲豬瘟病毒是否存在、及其病毒含量,其優點在于可將結果量化,通過明確的數據顯示結果,具有引物和探針的雙重特異性,因此實時熒光定量PCR 具有很強的特異性。 利用SYBR Green1 作為熒光染料即采用完全閉管式操作,避免了產物產生陽性污染,同時提高了檢測速度。 但是用這種方法測定非洲豬瘟病毒的存在,只能夠單管單測,且操作步驟復雜繁瑣,需要專業人員操作及專業實驗室。 董志珍等[6]設計出基于E183L基因的引物和探針,并建立了ASFV 熒光定量PCR 方法,這種方法可檢測小于15 copies∕μL 的病毒樣品,并獲得了國家專利。 根據OIE 推薦的保守區,King 等[7]建立了非洲豬瘟的TaqMan 探針熒光PCR 檢測方法,使用的熒光探針和引物均由B646L的高度保守區設計,靈敏度提高了10—100 倍。

2.3 重組酶聚合酶擴增(RPA)技術

RPA 技術是一種新興的可以在常溫下進行的核酸快速擴增技術,它模擬了DNA 在細胞中的擴增方式,在常溫且等溫的條件下,引物與重組酶形成聚合體,這種聚合體能夠促進引物與模板配對,單鏈DNA結合蛋白(SSB)能夠促進模板DNA 解旋,然后在DNA 聚合酶的作用下形成新的DNA 互補鏈。 其反應速度快,產物DNA 數量呈指數增加,一般反應時間小于10 min。 2016 年,王建昌等[8]建立了非洲豬瘟病毒的RPA 檢測方法,根據已知的非洲豬瘟病毒中P72 的保守區設計引物,設計出該病毒的RPA 檢測方法,通過這種方法,非洲豬瘟最低檢測到100 copies∕μL。 2017 年,李林等[9]對非洲豬瘟病毒的B646L基因的保守區設計引物,從而建立了非洲豬瘟病毒的RPA 檢測方法,該方法對非洲豬瘟病毒的檢測時間小于20 min,最低檢測限為16 copies∕μL,具有較高的靈敏度和較強的特異性;缺點是試劑成本較高。

2.4 LAMP 技術(環介導等溫擴增技術)

環介導等溫擴增核酸技術(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一種新興的核酸檢測技術。 2009 年,江彥增等[10]根據OIE 推薦的引物,建立了非洲豬瘟的LAMP 檢測方法,相比于OIE 的推薦的PCR 方法,此方法的靈敏度提高了100 倍。 本研究課題組利用非洲豬瘟病毒中P72 的保守區設計了3對引物,建立了非洲豬瘟病毒LAMP 檢測方法。 試驗結果用熒光進行顯色判斷,陽性產物為綠色,陰性產物為橘紅色,無需電泳即可進行可視化判斷。 這三對引物其中一對為環引物,用于識別目標序列中識別位置的特定擴展序列,這大大提高了核酸擴增的特異性,加快了反應速度。 LAMP 反應發生在恒溫條件下,只需要金屬浴、3 把移液器即可操作,設備簡單,總費用6 000 元(人民幣,下同);試劑成本低,一頭生豬試劑成本只需2 元。 根據對非洲豬瘟病毒的臨床檢測,LAMP 反應檢測靈敏度為2 copies∕μL,檢測時間為20 min。 具有高靈敏度,反應時間短,溫度要求低的優點。 在百級凈化車間,將試劑分裝為兩部分,A 試劑吹干在管蓋上,B 試劑分裝在PCR 管中,封裝好。 現場只需加樣一次,減化了操作步驟,減少了勞動強度和受污染的風險。 由于核酸染料在反應前體系配制時加入,反應后無需開蓋添加染料進行顯色,避免了開蓋產生的氣溶膠的污染。 試劑放置室溫可長達7 個月,避免了冷鏈運輸。 液體樣品可以直接加入反應體系作為模板,無需進行純化,固體樣品加入裂解液,95 ℃裂解10 min,上清液即可作為模板。 現場操作步驟簡單易學。 然而,LAMP 檢測方法也具有一定的局限性:靶序列要求較長,低于100 bp 無法設計引物。

3 展望

目前,全球尚無有效的非洲豬瘟疫苗可用于預防,有效的防控仍是對非洲豬瘟病毒進行檢測,落實及時發現、快速處置、精準管控。 根據檢測結果,對發生疫情的地方嚴防死守,對疫點地區生豬全部撲殺,進行無害化處理,防止疫情的擴散。 農業農村部要求生豬養殖、飼料廠、屠宰廠和流通環節必須嚴格進行非洲豬瘟病毒檢測。

現在非洲豬瘟病毒的檢測技術主要分為定量和定性兩個方面。 其中,定量主要是實時熒光定量PCR技術。 這種方法的優點在于特異性強,靈敏度較高,可以對試驗結果進行量化分析;缺點在于儀器設備成本高,需要專業人員進行操作,操作時間長,同時需要配備專業的實驗室,不適合現場檢測。 定性主要有ELISA、膠體金免疫層析試紙條、RPA 技術和LAMP 技術。 ELISA 的優點在于通量高,缺點在于靈敏度低,需要專業的實驗室和專業人員操作。 膠體金免疫層析試紙條優點在于可用于現場可視化檢測,操作方便;缺點在于靈敏度低,檢測結果需要根據臨床性狀和病史判斷,并且只能對死豬檢測,結果還需要核酸檢測驗證。 RPA 的優點在于靈敏度高,反應時間短,操作方便,可用于現場可視化檢測;缺點是試劑成本高。 LAMP 優點特異性強,靈敏度高,反應時間短,可用于現場可視化檢測,操作方便,試劑成本低;缺點是RPA 和LAMP 靈敏度非常高,容易污染,現場采取無污染操作措施要求高。

根據目前非洲豬瘟流行情況,現場檢測要求通量大和快速簡便,有時需要對結果定量分析,因此檢測方法應向兼顧定性定量、高通量方向發展。 另外,樣品制備、樣本的處理、核酸擴增和結果的顯示,應向自動化、一體化方向發展。