葛花總黃酮通過Nrf2/HO-1信號通路對1型糖尿病大鼠腎臟的保護作用

羅 影， 左中夫， 程 雪， 張 俏， 劉 暢， 閔連秋

(1.錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科一病區，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫科大學解剖學教研室，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科三病區，遼寧 錦州 121001)

糖尿病腎病人群逐年增加[1]，其主要致病因素為高血糖、高血壓和膽固醇水平[2]。氧化應激為機體的抗氧化系統失衡，為糖尿病腎病的重要發病機制之一。因此，控制血糖水平及抑制氧化應激反應對防治糖尿病腎病尤為重要[3-5]。核因子NF-E2相關因子(nuclear factor erythroid-2-related factor-2, Nrf2)與氧化應激密切相關，Nrf2對調節氧化應激所引發的細胞損傷修復過程尤為重要[5-6]。過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)會導致Nrf2/Kelch樣ECH相關蛋白-1(Keap1)復合物的破壞，進而與Keapl解耦聯，調節體內的氧化應激失衡[7]。Nrf2的激活會上調其下游關鍵的抗氧化酶血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的表達，進而拮抗體內的氧化應激反應[8]。

隨著中醫藥的發揚光大，天然中藥提取物在治療糖尿病腎病中扮演重要的角色[9-10]。葛花為傳統中藥，又名葛條花，可清熱消渴。葛花總黃酮為葛花的有效活性成分之一?，F代藥理學發現，葛花總黃酮能降低血糖并發揮強大的抗氧化功能[11]。研究發現，葛花總黃酮可有效降低1型糖尿病(T1DM)小鼠血糖及清除氧自由基，緩解糖尿病導致的認知功能損傷[12]。然而，葛花總黃酮對T1DM大鼠腎臟的影響尚不清楚。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制備T1DM模型，從氧化應激方面考慮葛花總黃酮對T1DM大鼠腎臟的緩解作用，為糖尿病腎病的防治提供新的可能藥物。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，購自錦州醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(遼)2009-2017，體質量180～220 g。實驗操作遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.2 試劑 鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號02000913，0.5 g/片)；葛花總黃酮(由錦州醫科大學化學實驗室提供，純度大于85%)，溶于蒸餾水中配成所需要質量濃度。STZ(美國Sigma公司)；兔抗大鼠Nrf2、兔抗大鼠HO-1、小鼠抗大鼠β-actin(英國Abcam公司)；HE染色試劑盒、熒光二抗、Western blot二抗(上海碧云天生物科技有限公司)；MDA、SOD檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 儀器 酶標儀(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 SD大鼠穩定2周后按55 mg/kg劑量腹腔一次性注射STZ，72 h后尾靜脈采血測血糖，將血糖濃度大于16.7 mmol/L者定為1型糖尿病大鼠模型，隨機分成5組，分別為模型組，葛花總黃酮低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、高劑量組(200 mg/kg)，二甲雙胍組(75 mg/kg)，另取10只正常大鼠作為正常對照組，成模1周后灌胃給藥，每天1次，劑量依據文獻[12-13]及本課題組預實驗。

2.2 標本采集及指標測定 實驗過程中檢測大鼠空腹血糖，處死前取血離心，分離得到的血清在-20 ℃下凍存，待測Scr、BUN水平。12周后，每組取5只大鼠，固定后處死，取出腎臟，石蠟包埋、切片，進行HE染免疫組織化學染色；另各組取5只大鼠腎臟，依據質量加蛋白裂解液，冰上剪碎，在4 ℃下離心25 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot檢測。

2.3 血清指標檢測 空腹血糖、Scr、BUN水平檢測采用全自動生化分析儀，MDA水平、SOD活性檢測采用ELISA試劑盒，具體步驟按照相關說明書執行。

2.4 HE染色 固定石蠟包埋制備的切片脫蠟后，PBS洗3次，蘇木素浸染2 min，自來水沖洗，伊紅浸染1 min，自來水沖洗，脫水透明后封片，拍照觀察。

2.5 大鼠腎臟Nrf2表達檢測 固定石蠟包埋制備的切片脫蠟后，PBS洗3次，加入3%H2O2，在室溫下靜置12 min，PBS洗3次，每次3 min，3%山羊血清室溫孵育30 min，不洗，滴加兔抗大鼠Nrf2(1∶600)，在4 ℃下過夜，PBS洗3次，每次3 min。滴加二抗，在室溫下靜置30 min，PBS洗3次，每次3 min，滴加SABC試劑，在室溫下靜置30 min，PBS洗3次，每次3 min，DAB顯色，復染、脫水、透明封片后在200倍視野下每張切片隨機挑選6個部位拍照，以棕黃色為判斷陽性表達的標準，應用Image J軟件分析同視野下陽性細胞與總細胞數的比值，作為Nrf2表達陽性率。

2.6 大鼠腎臟Nrf2、HO-1相對表達檢測 采用BCA法檢測蛋白濃度，電泳時加入15 μL樣品，在120 V下電泳，轉膜后1% BSA封閉2 h，加入一抗(Nrf2，1∶8 000；HO-1，1∶10 000)，在4 ℃下孵育過夜，TBST洗4次，每次5 min，加入二抗室溫2 h，TBST洗4次，每次5 min，ECL顯影，以β-actin為內參，采用Image J軟件分析灰度值。

3 結果

3.1 葛花總黃酮對大鼠血糖的影響 治療后，與正常對照組比較，模型組大鼠血糖升高(P<0.01);與模型組比較，葛花總黃酮各劑量組及二甲雙胍組大鼠血糖降低(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性，以100、200 mg/kg劑量作用更明顯，見表1。

表1 葛花總黃酮對大鼠血糖的影響

3.2 葛花總黃酮對大鼠Scr、BUN水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠Scr、BUN水平升高(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮各劑量組及二甲雙胍組大鼠Scr、BUN水平降低(P<0.05，P<0.01)，以100、200 mg/kg劑量作用更明顯，見表2。

表2 葛花總黃酮對大鼠Scr、BUN水平的影響

3.3 葛花總黃酮對大鼠腎臟病理學的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎小球體積增大，細胞外基質增生，并可見腎小管上皮細胞水腫；與模型組比較，葛花總黃酮100、200 mg/kg組及二甲雙胍組上述情況有所改善，見圖1。

圖1 葛花總黃酮對大鼠腎臟組織結構的影響(HE染色，×400)

3.4 葛花總黃酮對大鼠氧化應激的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MDA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮各劑量組及二甲雙胍組大鼠MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 葛花總黃酮對大鼠氧化應激的影響

3.5 葛花總黃酮對大鼠腎組織Nrf2表達的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2表達升高(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮100、200 mg/kg組大鼠腎組織Nrf2表達升高(P<0.01)，見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腎臟組織Nrf2表達(免疫組織化學染色，×400)

3.6 葛花總黃酮對大鼠腎組織Nrf2、HO-1表達的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2表達升高(P<0.01)，HO-1表達降低(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮100、200 mg/kg組Nrf2、HO-1表達均升高(P<0.01)，見圖3、表4。

表4 葛花總黃酮對大鼠腎組織Nrf2、HO-1表達的影響

注：A為正常對照組，B為模型組，C為葛花總黃酮50 mg/kg組，D為葛花總黃酮100 mg/kg組，E為葛花總黃酮200 mg/kg組，F為二甲雙胍75 mg/kg組。

4 討論

預計至2025年，全球糖尿病人群將高達3億[14]。糖尿病腎病為糖尿病常見并發癥，會引起腎結構異常，如系膜擴張、腎小球硬化、氧化應激和炎癥失衡等[15]，為腎功能不全患者致病的重要原因[16]。因此，探索一種更安全的治療糖尿病腎病的藥物尤為重要。糖尿病腎病狀態下，高糖血癥、炎癥因子等可引起活性氧族(ROS)堆積，進而加重糖尿病腎病[17]，而外源性給予抗氧化應激藥物可對糖尿病腎病產生保護作用及減緩糖尿病腎病的發生發展[6, 18]。在本實驗中，發現葛花總黃酮100、200 mg/kg組及二甲雙胍75 mg/kg組可降低T1DM大鼠血糖、血肌酐和血尿素氮水平，同時HE染色顯示大鼠腎組織損傷程度明顯減輕，以上結果提示，本實驗設計合理，動物模型穩定，能夠驗證葛花總黃酮對T1DM大鼠的預防保護作用。

近年來研究發現，Nrf2信號通路對包括糖尿病腎病在內的多種以氧化應激為主要發病機制的疾病都具有保護作用。因此，在糖尿病腎病中通過誘導Nrf2治療的理論是有說服力的，動物研究明確支持這種方法的有效性[19]。許多研究表明，Nrf2激活劑，無論是合成的還是天然的，都能在糖尿病和小鼠模型中提供腎臟保護，改善蛋白尿、腎氧化損傷、炎癥、基質沉積、纖維化和組織病理學損傷[20-22]。一些Nrf2激動劑也存在于一些傳統上與腎臟健康相關的中藥制劑、茶葉和東方食物來源中[23-24]。Mittal等[25]證實，激活Nrf2通路后可減輕糖尿病小鼠腎功能不全及氧化應激水平。本研究發現，T1DM大鼠腎臟Nrf2表達有所增加，這可能為腎臟對抗氧化應激的適應性反應，然而HO-1表達卻降低，這可能與氧化應激反應過度消耗了自身Nrf2/HO-1通路激活而上調的HO-1，進而引起氧化應激損傷。而給予葛花總黃酮治療后，葛花總黃酮100、200 mg/kg組抗氧化能力增加，MDA水平降低，SOD活性增加，同時大鼠腎臟Nrf2、HO-1表達增加，提示葛花總黃酮在一定程度上可以激活Nrf2的表達，上調HO-1的表達，進而對抗T1DM大鼠腎臟損傷。本研究中，二甲雙胍對Nrf2/HO-1通路的調節作用并不明顯，這可能由于二甲雙胍并不通過該通路調節T1DM大鼠腎臟損傷，而主要通過調節腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase, p-p38MAPK)等通路對發揮防治糖尿病腎病的作用[26]。

綜上所述，葛花總黃酮可通過降低T1DM大鼠血糖、血肌酐和血尿素氮水平，增強大鼠抗氧化能力進而緩解T1DM大鼠腎臟損傷，其機制可能與降低血糖和激活Nrf2/HO-1信號通路有關。當然，T1DM發病機制復雜，葛花總黃酮對調控此信號通路進而對T1DM大鼠腎臟損傷的防治效果有待進一步深入探討。