人參口服液澄清工藝的優(yōu)化

章國磊， 王 靜， 李珺銘， 焦麗麗， 李 慧*， 吳 巍*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.遼寧海思科制藥有限公司，遼寧 沈陽 110168)

口服液是以湯劑為基礎(chǔ)發(fā)展起來的無菌或半無菌口服液體制劑[1]，不但保留了湯劑原有特色，而且具有吸收快、奏效迅速、服用方便等優(yōu)點。人參是我國名貴中藥材，具有增強記憶力、提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等作用[2-6]，是市場上常見補益品，其口服液在增強機體免疫力、抗疲勞、調(diào)節(jié)血壓等方面均表現(xiàn)出很好的療效[7-8]，近年來獲得了快速發(fā)展，并且在保健食品市場上占有很大份額，具有廣闊的發(fā)展前景。但人參口服液大多以水為提取溶劑，通過加熱回流的方式制備，其間容易提取出淀粉、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)等可溶性高分子成分，常呈膠體分散或相互增溶狀態(tài)[9]，在貯存中出現(xiàn)渾濁、沉淀，造成澄明度較差等問題。目前，改善液體制劑澄明度的方法主要有醇沉法[10]、殼聚糖絮凝法[11]、凍融法[12]，本實驗以人參皂苷、凍干粉含量為評價指標，對這3種澄清工藝進行比較篩選，以期為其他中藥口服液澄清工藝的研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(Q-TOF)(美國Agilent公司)；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-1100型凍干機(東京理化器械株式會社)；KQ-3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RCT-3200型超純水機(長春市萊博帕特有限公司)；902-ULTS型超低溫冰箱(美國賽默飛世爾科技公司)；Synergy 2多功能微孔板檢測儀(美國Bio-Tek公司)。

1.2 試劑與藥物 4年生全須生曬參(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司)，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Meyer的干燥根莖。香草醛(薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司)。甲醇、甲酸、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)；冰醋酸、高氯酸等均為分析純(北京化學(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液制備 將生曬參粉碎后過40目篩，稱取50 g，加500 mL超純水加熱回流提取3次，時間分別為2、2、1 h，料液比分別為1∶10、1∶8、1∶8，合并濾液，在60 ℃下減壓濃縮至1 000 mL，過濾，即得。

2.2 凍干粉制備 精密量取“2.1”項下提取液50 mL，置于-80 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍24 h后再放到低溫冷凍干燥機中凍干36 h，即得，稱定質(zhì)量。

2.3 總皂苷及皂苷單體含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱定人參皂苷Re對照品2 mg，置于2 mL量瓶中，甲醇溶解后定容至2 mL，過0.22 μm微孔濾膜，即得(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)。

2.3.2 供試品溶液制備 精密量取“2.1”項下提取液5 mL，置于分液漏斗中，加入5 mL超純水，乙醚脫脂3次，每次20 mL，收集合并下層水相，加水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇層，60 ℃水浴蒸干，甲醇定容至10 mL量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取人參皂苷Re對照品溶液40、80、120、160、200、240 μL，置于10 mL具塞刻度試管中，氮氣吹干，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸溶液0.8 mL，混勻，60 ℃水浴加熱15 min，流水冷卻，冰醋酸5 mL終止反應(yīng)，在550 nm波長處測吸光度。以人參皂苷Re質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=12.769X+0.040 3(r=0.999 1)，在5.46～36.40 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 總皂苷含量測定 按“2.3.3”項下方法檢測吸光度，根據(jù)回歸方程測定總皂苷含量。

2.3.5 皂苷單體含量測定 采用四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(Q-TOF)法測定。

2.3.5.1 色譜條件 C18色譜柱(50 mm×3 mm，2.7 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，15%～19%B；5～10 min，19%B；10～28 min，19%～26%B；28～38 min，26%～60%B；38～42 min，60%～100%B)；體積流量0.5 mL/min；檢測波長550 nm；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

2.3.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，負離子模式；掃描范圍m/z200～1 500；霧化器溫度300 ℃；干燥氣(N2)體積流量9 L/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化器壓力45 psi(1 psi=6.895 kPa)。

2.4 澄清工藝考察

2.4.1 凍融法 精密量取5份“2.1”項下提取液，每份50 mL，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍，每次24 h，在4 ℃下避光靜置24 h，濾過，觀察澄明度，測定總皂苷、凍干粉含量，結(jié)果見表1。

表1 凍融法對澄清效果的影響

譚蔚等[13]報道，凍融可使蠶砂提取液中的粒子產(chǎn)生明顯凝聚而沉淀，在保留有效成分的同時改善提取液澄明度；表1顯示，凍融法雖能有效保留總皂苷、凍干粉含量，但無法有效改善口服液澄明度，可能是由于該方法不能有效去除淀粉、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)等可溶性雜質(zhì)，而且凍融次數(shù)的增加會造成生產(chǎn)成本提高，故不予考慮。

2.4.2 醇沉法 參考文獻[14]報道，精密量取5份“2.1”項下提取液，每份50 mL，分別加入一定量乙醇使其體積分數(shù)達到20%、30%、40%、50%，4 ℃避光靜置24 h，過濾，在60 ℃下濃縮至無醇味，觀察澄明度，測定總皂苷、凍干粉含量，結(jié)果見表2。

表2 醇沉法對澄明效果的影響

由此可知，當乙醇體積分數(shù)達到40%時，在有效提高總皂苷、凍干粉的含量前提下，口服液澄明度也得到了改善，但少量淀粉、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)等可溶性雜質(zhì)可能未有效除去，導(dǎo)致凍干粉含量增加，并且該工藝增加了乙醇的用量，操作復(fù)雜。王柏強等[15]在優(yōu)化杜仲葉水提液除雜工藝過程中發(fā)現(xiàn)，醇沉法除雜后藥液中雜質(zhì)沉淀速度慢，導(dǎo)致醇沉法生產(chǎn)周期較長，生產(chǎn)成本提高，故不予考慮。

2.4.3 殼聚糖絮凝法

2.4.3.1 殼聚糖質(zhì)量分數(shù)篩選 殼聚糖是蝦殼、蟹殼經(jīng)酸處理后得到的陽離子堿性多糖，無毒無味，可生物降解[16]，可通過電中和吸附等作用將體系中的懸浮物及膠體粒子去除，使其澄明度提高[17]，并且對于大部分藥材提取液均能起到一定的澄清作用，可充分保留有效成分，明顯提高轉(zhuǎn)移率[18-22]。取1 g殼聚糖，1%醋酸分別制成0.5%、1%、2%絮凝劑，磁力攪拌后靜置24 h，加入3份“2.1”項下提取液中，每份50 mL，在4 ℃下避光靜置24 h，濾過，觀察澄明度，結(jié)果見表3。由此可知，1%殼聚糖對提取液中雜質(zhì)有較強的吸附作用，析出沉淀量較多，同時沉淀物較大的比表面積也將不溶微粒一同除去，而且澄清速度快，澄明度明顯改善。

表3 殼聚糖質(zhì)量分數(shù)對澄明效果的影響

2.4.3.2 殼聚糖用量篩選 殼聚糖對淀粉、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)等可溶性雜質(zhì)具有較強的吸附作用，形成不溶于水的高分子復(fù)合物沉淀，沉淀物較大的表面積也能吸附中藥提取液中不溶性的微粒，使得藥液澄清[23]。精密量取5份“2.1”項下提取液，每份50 mL，置于100 mL錐形瓶中，1%殼聚糖絮凝劑分別以4%、5%、6%、7%、8%用量加入，在4 ℃下避光靜置24 h，濾過，觀察澄明度，測定總皂苷、凍干粉含量，結(jié)果見表4。由此可知，用量為6%時總皂苷損失較小，澄明速度較快，凍干粉含量較低，可能是殼聚糖的除雜效果較好，同時提取液澄明度顯著改善，放置后溶液穩(wěn)定性良好。

表4 殼聚糖用量對澄明效果的影響

2.4.4 殼聚糖用量對皂苷單體含量影響 取質(zhì)量分數(shù)為1%、用量為6%的殼聚糖，加到50 mL提取液中，在4 ℃下避光靜置24 h，濾過，測定皂苷單體含量，結(jié)果見表5、圖1。由此可知，各皂苷單體含量在加入殼聚糖的變化較小，表明殼聚糖絮凝法處理不會對其產(chǎn)生明顯破壞作用。

表5 殼聚糖用量對皂苷單體含量的影響

圖1 皂苷單體總離子流圖

2.4.5 澄清方法比較 表6顯示，3種澄清方法均能在有效保證總皂苷、凍干粉含量的前提下，不同程度地改善口服液的澄明度，其中凍融法下兩者含量相對較高，但澄明度不理想，可能是由于該方法未能實現(xiàn)對可溶性雜質(zhì)微粒的有效聚集、沉淀、去除；醇沉法下人參總皂苷保留率降低，凍干粉保留率升高，澄明度不理想，可能是因為該工藝對可溶性雜質(zhì)的去除率較低；殼聚糖絮凝法下總皂苷含量較高，凍干粉含量降低，表明殼聚糖可實現(xiàn)對可溶性雜質(zhì)有效去除，并且澄明度也得到顯著改善。另外，殼聚糖不破壞有效成分，本身不產(chǎn)生藥理作用，用量少，不殘留，與人體有良好的生物相容性和降解性[24]，而且相關(guān)工藝簡便，成本較低，生產(chǎn)周期短，是一種理想的澄清劑。

表6 3種澄清方法比較結(jié)果

2.4.6 澄明度穩(wěn)定性試驗 澄明度穩(wěn)定性是口服液制備過程中的關(guān)鍵問題，可反映其外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量[25]。精密量取12份質(zhì)量分數(shù)為1%、用量為6%的殼聚糖、采用殼聚糖絮凝法處理后的口服液，每份50 mL，封裝于12個無色玻璃瓶中，分為4組，每組3份，在4 ℃下避光靜置90 d，觀察澄明度，測定總皂苷、凍干粉含量，結(jié)果見表7。由此可知，總皂苷、凍干粉含量無明顯變化，口服液澄清，長時間放置無可視沉淀產(chǎn)生，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表7 澄明度穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=3)

3 討論

人參口服液含有多糖等成分，在乙醇沉淀過程中會有一定損失，而它作為以水為溶劑提取獲得的制劑，該方法效果較差。凍融法是通過反復(fù)凍融過程改變?nèi)芤褐蟹肿有螒B(tài)，使其產(chǎn)生沉淀析出的一種方法，它不僅生產(chǎn)周期較長、沉淀效果有限，而且容易影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，也不適合澄清人參口服液。殼聚糖是一種天然陽性離子堿性多糖，可作為陽離子絮凝劑發(fā)揮電中和凝聚、粘結(jié)架橋絮凝的雙重作用，對人參提取液具有很好的澄清效果，其口服液長時間貯存時能保持較高的澄明度，而且無可視沉淀產(chǎn)生，具有用量少、生產(chǎn)周期短、成本低、澄明度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣闊，可為其他中藥口服液澄清研究提供理論依據(jù)。