川芎化學成分及其抑制子宮平滑肌收縮作用(Ⅱ)

馮 芮， 彭 成， 周 飛， 郭 力， 劉 娟*， 熊 亮*

(1.成都中醫藥大學藥學院省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都中醫藥大學西南特色藥材創新藥物成分研究所，四川 成都 611137)

川芎為傘形科藁本屬多年生草本植物LigusticumstriatumDC.(同名Ligusticumchuanxiong)的干燥根莖，為著名川產道地藥材。其性辛、溫，歸肝、膽、心包經，具有祛風止痛、活血行氣的功效。川芎生物堿是川芎重要的活性部位，在心腦血管保護[1-2]、抗偏頭痛[3]、抗血小板聚集[4]、神經保護[5]和抑制子宮平滑肌收縮[6]等方面發揮著重要作用，目前針對川芎生物堿成分的研究主要集中在川芎嗪，對于其他生物堿成分研究較少，截止目前，僅報道了20余種生物堿類成分[7-10]，因此，針對川芎生物堿類成分研究具有較好的創新性。本課題組前期首次發現其能顯著抑制子宮平滑肌收縮[6]。但川芎生物堿抑制子宮平滑肌的物質基礎尚不清楚，課題組又進一步明確了二酮哌嗪生物堿是抑制子宮平滑肌收縮的物質基礎[10]。為進一步完善和豐富川芎生物堿類成分，彌補川芎抑制子宮平滑肌物質基礎研究的匱乏，本課題組對川芎生物堿部位進行持續研究，從中獲得了10個生物堿化合物，并結合縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮模型考察其對子宮平滑肌收縮活動的影響，發現化合物2、5在50 μmol/L時具有抑制大鼠離體子宮平滑肌收縮作用。

1 材料

1.1 儀器 Búchi Gradient Former B-687中壓液相色譜儀(瑞士Búchi公司)；Agilent 1220型半制備型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Bruker AVANCE NEO-600 核磁共振波譜儀、Bruker AVANCE NEO-700 核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；D101大孔吸附樹脂(成都科龍化工試劑廠)；732型陽離子交換樹脂(河北華偉樹脂廠)；柱層析硅膠(200～300目，青島海洋硅膠干燥劑廠)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia公司)；薄層層析硅膠GF254(青島海洋硅膠干燥劑廠)；高效薄層GF254、硅膠制備薄層(煙臺江友硅膠開發有限公司)；FA2004B電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；Powerlab多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽和Labchart Pro專業版軟件[澳大利亞埃德儀器國際貿易(上海)有限公司]；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 試劑 95%乙醇、正丁醇、氨水、甲醇、二氯甲烷、二甲亞砜等分析純試劑(成都科隆化工試劑廠)；色譜甲醇，4 L/瓶(美國Sigma公司)；顯色劑碘蒸氣、改良碘化鉍鉀試劑(上海易恩化學技術有限公司)。縮宮素注射液(江西省創欣藥業集團有限公司，批號191011，規格2 mL:10單位，使用時用生理鹽水配成 1 U/mL)；戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號498A，規格1 mg/片，使用時用純水制備成0.8 mg/mL)。

1.3 藥材 川芎飲片由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司提供，經成都中醫藥大學高繼海副教授鑒定為傘形科多年生草本植物川芎LigusticumstriatumDC.的根莖，標本(LC-20161030)現保存在成都中醫藥大學“省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室”。

1.4 動物 健康未孕成年SD大鼠，普通級，雌雄，體質量220～250 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供[動物生產許可證號SCXK(川)2015-030]。

2 提取與分離

100 kg干燥川芎，煎煮3次(每次8倍量純水，2.5 h)，合并水煎液濃縮后得到川芎水提取物(28.8 kg)。該水提物用正丁醇萃取，濃縮后得到正丁醇萃取物(9.3 kg)。正丁醇萃取物再用D101大孔吸附樹脂進行分離，用0%、10%、30%、50%、70%、95%乙醇進行梯度洗脫，濃縮后得到6個洗脫部位。取30%乙醇水洗脫部位(701 g)用離子交換樹脂進行生物堿富集，依次用純水、75%乙醇、75%氨水乙醇梯度洗脫，回收溶劑得到3個洗脫部分。將75%氨水乙醇部分(120 g)采用硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶1)洗脫，獲得9個餾分(F1～F9)。

采用反相中壓液相色譜分離餾分F6，甲醇溶液(10%～100%)梯度洗脫后得到9個洗脫部分(F6-a～F6-i)，F6-c采用反相Sephadex LH-20柱，以85%甲醇水溶液洗脫后得到7個部分(F6-c-1～F6-c-7)，F6-c-2經硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇(80∶1～0∶100)梯度洗脫得到5個部分(F6-c-2a～F6-c-2e)，F6-c-2a經反相半制備高效液相色譜，以甲醇-水(30∶70)處理后得化合物1(3.0 mg)、2(2.7 mg)。F6-c-2b經制備薄層色譜，以二氯甲烷-甲醇(13∶1)洗脫和反相半制備高效液相色譜(46%甲醇-水溶液)處理后得化合物3(1.0 mg)、4(2.8 mg)。F6-c-3經硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(80∶1～0∶100)梯度洗脫得到6個部分(F6-c-3a～F6-c-3f)，F6-c-3b經制備薄層色譜，二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫和反相半制備高效液相(40%甲醇-水溶液)處理后得化合物5(4.3 mg)、6(0.8 mg)、7(3.1 mg)。F6-c-4經硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶100)梯度洗脫得到8個部分(F6-c-4a～F6-c-4h)，F6-c-4c經制備薄層色譜，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫和反相半制備高效液相色譜(50%甲醇-水溶液)處理后得化合物8(0.7 mg)。F6-c-5經硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶100)梯度洗脫得到7個部分(F6-c-5a～F6-c-5g)，F6-c-5b和F6-c-5d經反相半制備高效液相色譜，分別以甲醇-水(62∶38)和甲醇-水(60∶40)處理后得到化合物9(0.9 mg)、10(3.2 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：257.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.34～7.21(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.24～4.20(1H，m，H-3)，3.85～3.82(1H，m，H-6)，3.44(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7a)，3.24(1H，dd，J=6.6，13.8 Hz，H-8a)，3.12(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-8b)，2.88(1H，dd，J=6.0，10.8 Hz，H-7b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.5(C-5)，168.2(C-2)，137.3(C-9)，131.3(2C，C-10，14)，129.7(2C，C-11，13)，128.2(C-12)，64.7(C-7)，58.7(C-6)，57.6(C-3)，41.6(C-8)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定為環(L-苯丙氨酸-L-絲氨酸)。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：257.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.31～7.21(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.31(1H，t，J=4.2 Hz，H-3)，3.75(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7a)，3.56(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7b)，3.26(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-8a)，3.05～2.98(2H，m，H-6，8b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.2(C-5)，169.1(C-2)，136.5(C-9)，131.5(2C，C-10，14)，129.5(2C，C-11，13)，128.3(C-12)，63.5(C-7)，57.6(C-6)，57.3(C-3)，40.4(C-8)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定為環(D-苯丙氨酸-L-絲氨酸)。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：298.1[M+Na]+，分子式C14H17N3O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)，δ:7.29(2H，t，J=7.2 Hz，H-14，16)，7.24(1H，t，J=7.2 Hz，H-15)，7.21(2H，d，J=7.2 Hz，H-13，17)，4.33(1H，t，J=4.8 Hz，H-3)，3.81(1H，t，J=6.0 Hz，H-6)，3.31(1H，m，H-11a)，2.95(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-11b)，1.84(2H，t，J=8.4，CH2-8)，1.30(1H，m，H-7a)，1.00(1H，m，H-7b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：174.2(C-9)，169.3(C-5)，169.0(C-2)，136.7(C-12)，131.7(2C，C-13，17)，129.6(2C，C-14，16)，128.5(C-15)，57.4(C-3)，54.8(C-6)，40.0(C-11)，30.4(C-8)，30.0(C-7)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為環(L-苯丙氨酸-L-谷氨酰胺)。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：241.1[M+Na]+，分子式C13H18N2O。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.30～7.24(2H，m，H-11，15)，7.24～7.19(3H，m，H-12，13，14)，4.31(1H，t，J=5.4 Hz，H-2)，3.64(1H，d，J=4.2 Hz，H-5)，3.23(1H，dd，J=5.4，13.8 Hz，H-6a)，3.04(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-6b)，1.64(1H，m，H-7)，0.79(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-8)，0.43(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-9)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.4(C-4)，137.1(C-10)，131.5(2C，C-11，15)，129.6(2C，C-12，14)，129.2(C-13)，61.3(C-5)，57.3(C-2)，40.1(C-6)，33.3(C-7)，19.1(C-8)，17.1(C-9)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定為2-isopropyl-5-phenylmethyl-imidazolidinone-4-one。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：241.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O2。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.33～7.19(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.31(1H，t，J=4.2 Hz，H-3)，3.76(1H，q，J=7.2，13.8 Hz，H-6)，3.28(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-8a)，2.96(1H，q，J=4.2，13.8 Hz，H-8b)，0.52(1H，d，J=7.2 Hz，CH3-7)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.6(C-2)，168.5(C-5)，136.6(C-9)，131.8(2C，C-10，14)，129.5(2C，C-11，13)，128.3(C-12)，57.4(C-6)，51.7(C-3)，40.3(C-8)，20.4(C-7)。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定為環(L-苯丙氨酸-L-丙氨酸)。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：299.1[M+Na]+，分子式C15H20N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.02(2H，d，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.70(2H，d，J=7.8 Hz，H-14，16)，4.26(1H，m，H-3)，3.70(1H，m，H-6)，3.18(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-11a)，2.89(1H，dd，J=6.4，13.8 Hz，H-11b)，1.41(1H，m，H-7)，1.18(1H，m，CH2-9)，0.76(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-8)，0.71(3H，t，J=7.2 Hz，CH3-10)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.0(C-5)，167.9(C-2)，157.0(C-15)，132.6(2C，C-13，17)，127.2(C-12)，116.3(2C，C-14，16)，60.9(C-6)，57.5(C-3)，39.8(C-7)，38.9(C-11)，24.7(C-9)，15.4(C-8)，11.9(C-10)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定為環(L-酪氨酸-L-亮氨酸)。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm/z：333.1[M+Na]+，分子式C18H18N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.34(2H，t，J=7.2 Hz，H-17，19)，7.25(1H，t，J=7.2 Hz，H-18)，7.11(2H，d，J=7.2 Hz，H-16，20)，6.94(2H，d，J=7.8 Hz，H-9，13)，6.76(2H，t，J=7.8 Hz，H-10，12)，4.07(1H，m，H-3)，4.05(1H，m，H-6)，2.81(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-14a)，2.72(1H，dd，J=3.6，13.8 Hz，H-7a)，2.19(1H，dd，J=6.6，13.8 Hz，H-7b)，2.10(1H，dd，J=7.2，13.8 Hz，H-14b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.2(C-5)，169.1(C-2)，157.9(C-11)，137.3(C-15)，132.3(2C，C-9，13)，131.1(2C，C-16，20)，129.8(2C，C-17，19)，128.2(C-18)，127.6(C-8)，116.5(2C，C-10，12)，57.7(C-6)，57.5(C-3)，41.2(C-14)，40.2(C-7)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定為環(L-苯丙氨酸-L-酪氨酸)。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯橘紅色。ESI-MSm/z：147.1[M+H]+，分子式C8H6N2O。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：8.24(1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-5)，8.10(1H，s，H-2)，7.85(1H，td，J=1.2，7.8 Hz，H-6)，7.71(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)，7.57(1H，td，J=1.2，7.8 Hz，H-7)。以上數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定為4(3H)-喹唑酮。

化合物9：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯橘紅色。ESI-MSm/z：146.1[M+H]+，分子式C9H7NO。1H-NMR(CD3OD，700 MHz)δ：8.52(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，7.91(1H，d，J=7.7 Hz，H-8)，7.75(1H，m，H-5)，7.55～7.49(3H，m，H-4，6，7)；13C-NMR(CD3OD，175 MHz)δ：152.7(C-3)，144.5(C-8a)，143.6(C-2)，131.0(C-4a)，128.8(C-8)，128.3(C-6)，127.7(C-7)，127.6(C-5)，117.9(C-4)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定為3-羥基喹啉。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯橘紅色。ESI-MSm/z：169.1[M+H]+，分子式C11H8N2。1H-NMR(CD3OD，700 MHz)δ：8.96(1H，s，H-4)，8.28(1H，m，H-7)，8.04(1H，m，H-8)，7.62(1H，d，J=3.5 Hz，H-2)，7.61～7.56(2H，m，H-6，9)，7.13(1H，d，J=3.5 Hz，H-1)；13C-NMR(CD3OD，175 MHz)δ：142.8(C-5a)，138.6(C-4)，130.6(C-9b)，130.1(C-3a)，129.4(C-2)，129.1(C-8)，127.2(C-6)，127.0(C-9)，125.1(C-9a)，124.4(C-7)，101.8(C-1)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定為marinoquinoline K。

4 對大鼠離體子宮平滑肌收縮活動的影響

川芎生物堿成分對縮宮素致子宮平滑肌收縮活動影響的實驗結果，見表1，與空白組比較，化合物2、5對子宮平滑肌收縮活動影響較小，僅在50 μmol/L時表現出對子宮平滑肌收縮張力有影響(P<0.05)，12.5、25 μmol/L濃度下對子宮平滑肌收縮作用均不明顯(P>0.05)。本研究結果與前期基礎實驗結果一致，進一步明確了二酮哌嗪生物堿是抑制子宮平滑肌收縮的物質基礎。

表1 各化合物對子宮平滑肌收縮活動的影響

5 討論

本實驗遵循川芎傳統使用方法，持續對其水煎液進行研究，從水煎液正丁醇部位中獲得10個生物堿類化合物，這些生物堿均為首次從川芎中分離得到，包含6個二酮哌嗪類生物堿(1～3、5～7)、1個咪唑啉酮類(4)、1個喹唑酮類(8)以及2個喹啉類生物堿(9～10)。其中，與大部分生物堿的碘化鉍鉀顯橘紅色不同的是，二酮哌嗪多顯藍色，可為后續二酮哌嗪的快速分離提供參考。川芎生物堿作為川芎的重要活性部位，具有腦保護、神經保護、抗偏頭痛、抗心肌缺血、舒張子宮平滑肌等多種藥理活性。而目前主要針對吡嗪類生物堿川芎嗪進行廣泛而深入的研究，包括提取工藝、含量測定、人工合成、活性機制等，其他生物堿研究報道很少，相較于之前報道的20余個生物堿化合物[7-10]，本實驗進一步豐富了川芎化學成分，以期彌補川芎生物堿類成分報道的缺乏。

二酮哌嗪是廣泛存在于自然界的最小環肽類化合物，現代藥理研究表明二酮哌嗪類生物堿具有抗細菌、抗真菌、抗病毒等多種藥理活性。本課題組前期發現川芎生物堿對子宮平滑肌收縮具有顯著的抑制作用，并發現其中的活性成分(二酮哌嗪生物堿)，本實驗在前期實驗基礎之上，考察了川芎生物堿成分抑制子宮平滑肌收縮活性，并發現化合物2、5也具有一定的舒張子宮平滑肌作用，進一步明確了二酮哌嗪生物堿是抑制子宮平滑肌收縮的物質基礎，以期為闡釋川芎傳統功效提供參考。