山銀花提取物的抑制酪氨酸酶活性

易燦，周新崇，劉進(jìn)兵

邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院（邵陽(yáng) 422000）

山銀花作為忍冬科植物，是一種大宗中藥材，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，臨床上用于治療咽喉腫痛、風(fēng)熱感冒等疾病[1]，主要產(chǎn)區(qū)為湖南隆回縣和重慶秀山[2]。山銀花主要活性成分為有機(jī)酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類及皂苷類、揮發(fā)性物質(zhì)[3]，山銀花與金銀花活性成分不同，研究者發(fā)現(xiàn)，與金銀花比較，山銀花中綠原酸成分較多，木犀草苷成分較少，并含有金銀花目前未發(fā)現(xiàn)的皂苷類成分[4]。在藥理作用方面，研究者發(fā)現(xiàn)山銀花具有抗氧化性、抗菌抗炎、抗病毒、抗過(guò)敏、保肝利膽等功效[5-6]。

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，tyrosinase）是一種具有耦合雙核銅活性位點(diǎn)的金屬酶，其中每個(gè)銅離子與3個(gè)組氨酸殘基螯合，這種多功能酶催化銅在氧分子存在下氧化苯酚和鄰苯二酚[7]。酪氨酸酶作為參與酶促褐變的主要物質(zhì)，是黑色素合成的關(guān)鍵酶及唯一限速酶，對(duì)皮膚、毛發(fā)的顏色起關(guān)鍵作用[8]，酪氨酸酶表達(dá)異常可直接或間接導(dǎo)致非腫瘤性皮膚色素沉著障礙[9]。酪氨酸酶還能引發(fā)果蔬褐變?cè)斐墒称奉伾⑽兜雷兞樱踔廉a(chǎn)品腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失，產(chǎn)品貨架期縮短，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)功效和商業(yè)價(jià)值造成損害。所以酪氨酸酶抑制劑在食品防腐添加劑、預(yù)防或治療色素沉著障礙的藥物和化妝品中的應(yīng)用得到越來(lái)越多研究[10]。大多數(shù)酪氨酸酶抑制劑為化學(xué)合成，具有一定毒副作用。因此，從自然界中尋找安全低毒、高效的酪氨酸酶抑制劑越來(lái)越受到研究者關(guān)注。

試驗(yàn)探討山銀花不同溶劑萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，運(yùn)用酶動(dòng)力學(xué)探討其抑制機(jī)制，為進(jìn)一步綜合利用山銀花資源提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

隆回山銀花（湖南省隆回縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）；曲酸（純度≥97%）、蘑菇酪氨酸酶（T3824-25KU）（上海阿拉丁生化科技有限股份公司）；左旋多巴（L-DOPA，純度≥99%，Johnson Matthey化學(xué)公司）；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器（鞏義市中天儀器科技有限公司）；PT-3502C全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；Cary Edipse熒光分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取分離

稱取經(jīng)中草藥粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)0.250 mm（60目）篩且石油醚脫脂12 h的粉末的干燥金銀花20 g，在料液比1∶20（g/mL），微波功率400 W，乙醇濃度60%、提取時(shí)間8 min條件下提取，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至浸膏，加適量水混勻后，先后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相部分，減壓濃縮后，干燥，所得浸膏用75%乙醇配制成各濃度溶液。

1.2.2 體外抑制酪氨酸酶活性測(cè)試

1.2.2.1 對(duì)酪氨酸酶活性抑制效果分析

利用L-DOPA為底物，研究山銀花對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果[11]。將山銀花石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏配制成初始質(zhì)量濃度1 000 mg/L的溶液，試驗(yàn)時(shí)分別稀釋成15.525~1 000 mg/L。在96孔板中依次加入160 μL 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L、pH 6.8）、20 μL待測(cè)樣品（其中空白組20 μL磷酸鹽緩沖液），20 μL酪氨酸酶溶液（0.2 mg/L）在28 ℃水浴條件下保溫孵化15 min后，加入20 μL L-DOPA溶液（10 mmol/L）、在475 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試，抑制率按式（1）計(jì)算。

式中：B為空白吸光度；S為樣品吸光度。

1.2.2.2 對(duì)酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

在以上抑酶效果測(cè)定體系中維持酪氨酸酶的濃度不變，改變體系中L-DOPA濃度，測(cè)定酶促反應(yīng)速率[12]。以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)和反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk曲線，根據(jù)直線交點(diǎn)的位置判斷山銀花萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制類型[13]。

1.2.3.3 熒光淬滅

山銀花萃取物對(duì)酪氨酸酶的熒光淬滅試驗(yàn)參照Han等[14]的方法。采用Stern-volmer方程對(duì)熒光淬滅數(shù)據(jù)分析。

式中：F0為熒光物質(zhì)的初始熒光強(qiáng)度；F為相互作用后熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)；Ksv為Stern-Volmer方程猝滅常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的熒光平均壽命，一般為10-8s；[Q]為熒光淬滅劑濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 山銀花提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

以曲酸為對(duì)照物，山銀花不同萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖1所示。4種山銀花萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，并呈量效關(guān)系，抑制能力大小為乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相＞水相，其水相抑制酪氨酸酶活性能力最差。由Origin 2018軟件分析得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水相、曲酸IC50值分別為468.18，276.29，447.99，767.26和38.58 mg/L。

圖1 曲酸和山銀花萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

2.2 山銀花萃取物對(duì)酪氨酸酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

因山銀花乙酸乙酯相對(duì)酪氨酸酶抑制效果最好，所以選擇此相進(jìn)行抑制動(dòng)力學(xué)分析。由圖2可知，隨著山銀花乙酸乙酯相的質(zhì)量濃度增大，直線斜率增大，且直線幾乎相交于橫軸的一點(diǎn)，最大反應(yīng)速率Vmax減小，米氏常數(shù)Km基本不變，由此推斷它對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型為非競(jìng)爭(zhēng)抑制型。根據(jù)Lineweaver-Burk方程（表1）計(jì)算得乙酸乙酯相的Km值約5.91 mmol/L。以各直線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)對(duì)山銀花乙酸乙酯相質(zhì)量濃度進(jìn)行二次作圖也可得到一條線性良好的直線，如圖3，通過(guò)這條直線與橫軸的交點(diǎn)可求得山銀花乙酸乙酯相對(duì)游離酶的抑制常數(shù)KI（KIS）為593.54 mg/L。

表1 山銀花乙酸乙酯相對(duì)酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程

圖2 山銀花乙酸乙酯相對(duì)酪氨酸酶抑制類型

圖3 山銀花乙酸乙酯相酶抑制常數(shù)KIS的測(cè)定

2.3 山銀花提取物對(duì)酪氨酸酶的熒光淬滅作用

在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下，0.5 U/mL酪氨酸酶在不同濃度山銀花乙酸乙酯相萃取物（0~100 mg/L）下的熒光光譜，如圖4所示。酪氨酸酶的熒光發(fā)射強(qiáng)度在355.84 nm處達(dá)到最大，隨著山銀花乙酸乙酯相濃度增加，酪氨酸酶的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度不斷降低，酪氨酸酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，可以推斷萃取物與酶發(fā)生相互作用，且對(duì)酶具有熒光猝滅作用[15]。

圖4 山銀花萃取物對(duì)酪氨酸酶的熒光作用

2.4 山銀花提取物對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)理

將山銀花乙酸乙酯相質(zhì)量濃度對(duì)F0/F-1作圖，結(jié)果如圖5所示。F0/F-1與[Q]呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)Stern-volmer方程計(jì)算的相關(guān)參數(shù)見表2。結(jié)果顯示，隨著溫度升高，淬滅常數(shù)Ksv、Kq減小，可判斷山銀花乙酸乙酯相對(duì)酪氨酸酶的熒光淬滅方式屬于靜態(tài)淬滅[16]。

圖5 山銀花乙酸乙酯相對(duì)酪氨酸酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖

表2 山銀花萃取物與酪氨酸酶相互作用的Stern-Volmer方程參數(shù)

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用微波輔助法提取山銀花有效成分，并用不同溶劑進(jìn)行萃取，對(duì)萃取物進(jìn)行體外酪氨酸酶抑制試驗(yàn)，優(yōu)選活性最強(qiáng)的萃取物并確定其抑制類型。結(jié)果顯示，山銀花不同溶劑萃取物具有一定酪氨酸酶抑制活性，其中山銀花乙酸乙酯相抑制酪氨酸酶能力明顯優(yōu)于其他山銀花萃取物，由酶促動(dòng)力學(xué)及熒光光譜法研究結(jié)果顯示，山銀花乙酸乙酯相和酪氨酸酶的相互作用是按照靜態(tài)淬滅進(jìn)行，其抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)抑制。后續(xù)可對(duì)山銀花乙酸乙酯相進(jìn)行分離純化研究，以期分離出活性高的抑制酶單體成分。試驗(yàn)結(jié)果為山銀花提取物在醫(yī)學(xué)、食品及化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。