基于網絡藥理學和分子對接探討益腎通絡補氣方對少弱精癥大鼠雌激素受體的影響

李新陽， 孫自學

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫院，河南 鄭州 450002)

目前，不孕不育已成為全球性的公共問題，約有20%的育齡夫婦受其困擾，男性因素中的少弱精子癥既是男性不育的主要原因之一，也是諸多生殖健康機構的重要研究課題[1]。少精子癥(Oligospermia)是指禁欲3～5 h后檢查精液，精子密度小于20×106/mL[2]；弱精子癥(Asthenospermia)則是指男性禁欲2～7 d后檢查精液，前向運動精子百分率<32%或(前向運動+非前向運動)精子百分率<40%，且精子濃度<15×106/mL[3]，二者合稱少弱精子癥，是引起男性不育最常見的病因之一。男性精子生成障礙是環境因素和遺傳因素相互作用的結果，主要由生殖道感染、內分泌激素紊亂、精索靜脈曲張、免疫異常及理化等復雜因素引起[4]。

《諸病源候論》曰：“丈夫無子者，其精清如水，冷如冰鐵，皆為無子之候”。因此，中醫認為少弱精子癥與古籍中“精少”“精冷”“精清”類似，其主要病機多為腎中精氣受損，致腎陰、腎陽平衡失調，從而形成陰陽俱損的表現。病因由于先天不足、房勞過度、內傷七情、飲食不節等，影響生殖功能，故本病治則多以滋陰補陽、補腎填精為主。益腎通絡補氣方，由菟絲子、淫羊藿、黃芪、黨參、枸杞子、川牛膝、熟地黃等藥物組成，是河南省中醫院孫自學教授臨床經驗方，具有補腎填精、健脾益氣、活血通絡之效。運用中醫學“腎藏精，主生殖”“陰為體，陽為用”理論，以該方治療少弱精子癥增強其補腎填精療效。方中菟絲子、淫羊藿具有補益腎陽、固精縮尿之功效，黃芪、黨參則能固表補中益氣，枸杞子滋腎補肝，川牛膝逐瘀通絡，熟地黃滋陰補血，此為益腎通絡補氣方中主要藥物。在現代藥理學研究中諸藥也具有抗氧化、抑制生精細胞凋亡等作用，這些對于精子的生成、成熟都具有重要意義[5]。為進一步研究益腎通絡補氣方的功效，本研究擬采用網絡藥理學方法和分子對接技術，從分子水平分析益腎通絡補氣方中有效成分，預測其作用靶點及相關信號通路，并設計相關實驗進行驗證，以期能闡明益腎通絡補氣方治療少弱精子癥的作用機制。

1 網絡藥理學

1.1 藥物活性成分篩選及活性成分靶點預測 以“菟絲子”“淫羊藿”“枸杞子”“黃芪”“熟地黃”“黨參”“川牛膝”“白術”“陳皮”為關鍵詞，從中藥系統藥理學數據庫及分析平臺[6](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)和中醫藥整合藥理學研究平臺[7](Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP)中檢索上述9味藥材的化學成分，并以生物利用度(OB)≥30%、藥物相似度(DL)≥0.18為標準進行活性成分篩選。

1.2 益腎通絡補氣方治療少弱精癥相關靶點篩選 以關鍵詞“Oligospermia”“Asthenospermia”在PharmGkb數據庫(https://www.pharmgkb.org/)、GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中檢索，得到少弱精子癥相關靶點，并與活性成分靶點與疾病靶點進行匹配，相同靶點即為益腎通絡補氣方治療少弱精子癥潛在靶點。采用Cytoscape v3.7.2軟件，構建藥物-活性成分-潛在靶點-疾病可視化聯系。

1.3 蛋白相互作用網絡構建 將益腎通絡補氣方治療少弱精子癥潛在靶點導入String數據庫(https://string-db.org/)進行分析，將結果導入Cytoscape v3.7.2軟件構建網絡圖，根據Degree值進行關鍵靶點分析。

1.4 基因本體論(GO)功能、京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 使用R語言軟件3.6.3版程序包Cluster Profiler 3.1.2，對益腎通絡補氣方治療少弱精子癥的潛在靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，設置閾值P<0.05，繪制柱狀圖與氣泡圖。

1.5 分子對接 根據“益腎通絡補氣方-有效成分-靶點-少弱精癥”網絡與益腎通絡補氣方治療少弱精癥潛在靶點蛋白互作網絡Degree值分析結果，KEGG富集分析結果結合相關文獻，發現ESR1，即雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)為益腎通絡補氣方治療少弱精癥的核心靶點(ERα在2個網絡中的Degree值分別為19、56)。將ERα對應的活性成分根據Degree值，篩選出排名前三的活性分子分別為柚皮素(naringenin)、芒柄花黃素(formononetin)、川陳皮素(nobiletin)。

在PDB和PubChem數據庫中，分別獲取ERα的PDB格式文件和ERα原配體雷洛昔芬(raloxifene)、naringenin、formononetin、nobiletin的SDF文件，采用Pymol軟件對ERα蛋白去水、加氫后，利用Autodock Vina1.1.2軟件進行分子對接。以ERα與原配體的結合能為參考，將結合能≤-5.0 kJ/mol作為活性成分配體與核心蛋白受體具有較好契合力的篩選標準[8]，結合能越低，結合活性越強，結構越穩定。

2 實驗驗證

2.1 材料

2.1.1 藥物 菟絲子、枸杞子、熟地黃、淫羊藿、黃芪、黨參、炒白術、陳皮、川牛膝均由河南省中醫院中藥房提供，預先加水浸泡40 min，武火煎煮至沸騰，文火分別濃縮至5.6、2.8、1.4 g/mL，置于-4 ℃冰箱至保存。益腎通絡補氣方臨床用量大致為菟絲子25 g、枸杞子15 g、熟地黃15 g、淫羊藿15 g、黃芪30 g、黨參15 g、炒白術15 g、陳皮12 g、川牛膝15 g，參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》換算，得到大鼠等效劑量為14.13 g/kg。

2.1.2 試劑 注射用環磷酰胺(批號9K344A，德國Baxter Oncology GmbH公司)；兔多抗ERα(批號Ab3575，英國Abcam公司)；兔多抗GAPDH(批號AB-P-R001，杭州賢至生物科技有限公司)；HRP標記兔抗羊二抗(批號BST12H03A60)、HRP標記羊抗兔二抗(批號BST13L04A54)(武漢博士德生物工程有限公司)。

2.1.3 儀器 恒溫水浴箱(太倉市實驗設備廠)；AE160型精密天平秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；BX-51型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；MK-3酶標儀(美國Thermo公司)；蛋白印跡電泳系統(北京六一儀器廠)。

2.1.4 動物 50只雄性SPF級健康成年SD大鼠，體質量(200±20)g，購自山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(晉)2015-000。

2.2 方法

2.2.1 分組與造模 50只大鼠適應性喂養1周后，隨機選取40只腹腔注射環磷酰胺35 mg/kg，連續5 d，建立少弱精癥大鼠模型；剩余10只腹腔注射等量生理鹽水，作為空白組。造模大鼠再隨機分為模型組及益腎通絡補氣方高、中、低劑量組，每組10只。

2.2.2 給藥 空白組大鼠第6天開始，連續2周灌胃給予生理鹽水；模型組大鼠造模成功后，第6天開始連續2周灌胃給予生理鹽水；益腎通絡補氣方高、中、低劑量組造模成功后，第6天開始連續2周分別灌胃給予益腎通絡補氣方28、14、7 g/kg(相當于臨床劑量的2、1、0.5倍)。

2.3 指標檢測

2.3.1 睪丸、附睪臟器指數 末次給藥12 h后，測定各組大鼠體質量，腹腔注射水合氯醛麻醉，取雙側睪丸、附睪，迅速稱定質量，同只大鼠臟器質量取雙側平均值，臟器指數=(臟器質量/體質量)×100%。

2.3.2 精液質量 末次給藥12 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，取附睪，置于3 mL、37 ℃生理鹽水中，組織剪剪碎，靜置1 min后37 ℃恒溫水浴5 min，輕輕搖晃使精子充分游出與生理鹽水混勻，采用GDYN-SCA型全自動精子質量分析系統分析精子濃度與活力。

2.3.3 Western blot檢測睪丸ERα蛋白表達 提取睪丸組織總蛋白，在-20 ℃下保存，根據標準蛋白濃度和相應的OD值計算直線回歸方程，計算樣品蛋白濃度，經制膠、電泳、轉膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫搖床封閉2 h，加入ERα(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，清洗后加入二抗(1∶50 000)，37 ℃搖床孵育2 h，清洗多余二抗，ECL顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結果

3.1 網絡藥理學

3.1.1 成分-靶點-疾病網絡 從TCMSP數據庫中根據OB與DL共篩選得到益腎通絡補氣方有效成分120個，見圖1。在PharmGkb、GeneCards數據庫中共篩選得到413個少弱精癥靶點，與有效成分對應的257個靶點進行匹配，得到17個益腎通絡補氣方治療少弱精子癥的潛在靶點。通過Cytoscape軟件將“益腎通絡補氣方-活性成分-靶點-疾病”進行可視化，見圖2～3。

圖1 “中藥-有效成分”網絡圖

圖2 “益腎通絡補氣方-有效成分-靶點-少弱精子癥”網絡圖

3.1.2 靶點蛋白互作網絡 將17個潛在靶點導入String數據庫分析，并保存結果為tsv格式，再將其導入Cytoscape軟件進行可視化，網絡圖靶點中面積越大，Degree值越大，即為在網絡中為關鍵靶點，見圖4。

圖3 “益腎通絡補氣方-少弱精子癥”共同靶點交集圖

圖4 益腎通絡補氣方治療少弱精子癥潛在靶點蛋白互作圖

3.1.3 GO功能注釋分析及KEGG富集分析 GO功能注釋分析結果顯示，潛在靶點共富集出1 002個條目，涉及生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)三個方面，見圖5。KEGG富集分析結果共得到37條通路，見圖6，包含雌激素信號通路、催乳素信號通路、p53信號通路等。

圖5 GO功能注釋分析(前10個條目)

圖6 KEGG富集分析(前30條通路)

3.1.4 分子對接 ERα蛋白與其原配體Raloxifene的結合能為-11.8 kJ/mol，naringenin、formononetin、nobiletin與ERα蛋白的結合能分別為-8.4、-7.1、-6.3 kJ/mol，均具有較好契合力，見圖7～8。

注：左側為局部圖，右側為整體圖。

注：左側為局部圖，右側為整體圖。

3.2 實驗驗證

3.2.1 睪丸、附睪臟器指數 與空白組比較，模型組大鼠睪丸、附睪臟器指數降低(P<0.01)；與模型組比較，益腎通絡補氣方低劑量組大鼠睪丸、附睪指數無明顯變化(P>0.05)，而中、高劑量組均升高(P<0.05，P<0.01)，以高劑量組更明顯(P<0.01)，見圖9。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2.2 精子濃度與活力 與空白組比較，模型組大鼠精子濃度與活力均下降(P<0.01)；與模型組比較，益腎通絡補氣方低、中、高劑量組大鼠精子濃度與活力均升高(P<0.05，P<0.01)，以中、高劑量組更為顯著(P<0.01)，見圖10。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2.3 睪丸組織ERα蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠ERα蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，益腎通絡補氣方低、中、高劑量組大鼠ERα蛋白表達均升高(P<0.01)，見圖11～12。

圖11 各組大鼠睪丸ERα蛋白表達(電泳圖)

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

4 討論

少弱精子癥已成為目前男性不育的關注焦點，但其具體病理機制尚未明確。近50%的不孕不育夫婦檢查后發現男性精液參數存在異常，其中少弱精子癥就占75%[9]。隨著不育男性逐漸增加，嚴重影響患者的身心健康以及和伴侶的家庭和諧。

中醫認為少弱精子癥是以腎精虧虛為本，夾雜濕熱、血瘀、痰濁、氣滯等，本標結合則為該病的基本病機。益腎通絡補氣方由河南省中醫院內制劑，主要用于補腎填精、健脾益氣、活血通絡，方中主要藥物菟絲子、淫羊藿、黃芪、黨參、枸杞子、川牛膝、熟地黃都是中藥復方中的常用經典藥物，臨床也應用廣泛。研究發現，含有菟絲子、淫羊藿、枸杞子等藥物的黃精贊育膠囊可明顯改善少弱精子癥大鼠睪丸組織形態，提高精子活力和數量，進而促進性腺軸功能恢復[10]；由李曰慶教授研制含有菟絲子-枸杞子藥對的補腎生精丸對腺嘌呤損傷造成的生精損傷大鼠生精細胞具有保護作用，其機制是通過抗氧化作用增強超氧化物歧化酶(SOD)活性、降低一氧化氮合酶(NOS)活性；影響一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)水平，同時也可抑制細胞凋亡[11-12]；淫羊藿育寶湯以淫羊藿為君藥采用以補腎溫陽法可有效改善腎陽虧虛型男性不育患者精液異常狀況，從而提升其授孕能力[13]；黃芪注射液也可通過ER發揮療效[14]。實驗發現，在補腎同時給以活血化瘀藥物對少弱精子癥也存在一定療效[15]。

經過網絡藥理方法篩選并結合大量文獻發現，與益腎通絡補氣方有效靶點的關聯度最高的是雌激素信號通路、催乳素信號通路、p53信號通路。研究顯示，雌激素在男性生殖中發揮重要作用，且睪丸和精液中含量很高，其受體廣泛分布于男性生殖系統睪丸、前列腺等器官中[16]。ERα在雄性生殖系統中的作用逐漸受到關注，其可通過配體依賴和非依賴途徑對雄性生殖功能起重要調節作用，可影響精子的發生和成熟[17]。研究發現，ERα敲除(ERαKO)小鼠模型附睪尾部出現明顯精子數量減少，運動活性降低等表現[18]。通過敲除成年雄性小鼠ERα基因后發現，該基因敲除小鼠睪丸發生萎縮，精子形態明顯異常且數目減少、并且生殖能力下降，最終導致不育現象[19]。雌激素作為生殖系統疾病關鍵激素，其相關受體ERα對于男性不育中少弱精子癥也存在重要影響。

通過GO富集分析得出，益腎通絡補氣方中有效成分對應靶點的生物過程及分子功能中，數目最多為小分子代謝過程的調控、細胞對氧化應激的反應、對類固醇激素的反應。其中氧化應激會引起類固醇合成相關酶的活性下降，從而對生殖重要激素——睪酮的合成和代謝產生影響；且睪丸氧化應激損傷同樣會導致生精細胞凋亡[20]。這些靶點均能對生殖相關性腺激素睪酮起調節作用，證實益腎通絡補氣方對治療男性不育相關疾病少弱精子癥存在一定療效。

經上述研究并結合分子對接結果顯示，ERα為益腎通絡補氣方治療少弱精癥的核心靶點。方中活性成分柚皮素、芒柄花黃素、川陳皮素與ERα蛋白均具有較好契合力，結合活性強且結構穩定。

為進一步驗證益腎通絡補氣方對少弱精子癥作用機制的網絡藥理學分析結果，本實驗研究益腎通絡補氣方對少弱精子癥大鼠睪丸、附睪臟器指數，精子濃度與活力，睪丸組織ERα蛋白表達的調控作用進行實驗驗證。結果發現，益腎通絡補氣方中、高劑量組睪丸指數、附睪指數、精子濃度與活力表達均呈升高趨勢，且以益腎通絡補氣方高劑量組顯著，并且益腎通絡補氣方低、中、高劑量組還可增高ERα蛋白表達。由此推測，益腎通絡補氣方可通過調控ERα表達達到改善精液質量的目的，對少弱精子癥具有治療效果。

綜上，益腎通絡補氣方對少弱精子癥具有明確的作用效果。本文基于網絡藥理學結合相關實驗驗證，研究益腎通絡補氣方對少弱精子癥的具體作用靶點及機制，為中藥復方治療少弱精子癥機制研究提供了方法借鑒，也對臨床運用中藥復方治療少弱精子癥提供重要理論和實驗依據。