天麻素對兔坐骨神經(jīng)擠壓傷修復作用探究

張賢平， 陳菲菲， 張 衡， 陳俊毅， 王銳英， 何 鵬， 高 峰， 黃昌釗

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541000)

近年來，周圍神經(jīng)損傷的病例數(shù)逐年增加，相關的診治成為了一大熱點及難點。手術的修復只是為神經(jīng)再生提供了基礎，人們還采取各種方法促進后續(xù)的功能恢復，其中藥物首當其沖[1]。如今臨床上常用的藥物有各類神經(jīng)生長因子，但是其昂貴的價格難以成為患者的首選。本實驗以家兔用鉗夾法[2]造模，模擬人周圍神經(jīng)擠壓傷，以期探索天麻素對外周神經(jīng)擠壓傷的療效及對神經(jīng)損傷的修復作用，為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供新的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 40只健康雄性新西蘭白兔(編號1107261911000699，動物生產(chǎn)許可證號SCXX(湘)2019-0015；級別為普通級)，體質(zhì)量1.5～2 kg，平均1.8 kg，由長沙市天勤生物科技有限公司提供，已經(jīng)過桂林醫(yī)學院動物實驗倫理審查。

分組，將40只實驗兔采用隨機數(shù)字表的方法分為模型對照組(生理鹽水5 mL/kg)、天麻素低劑量組(200 mg/kg肌注)、天麻素高劑量組(400 mg/kg肌注)、陽性藥組(甲鈷胺0.5 μg/kg肌注)，每組10只，分籠專人飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 天麻素注射液(中國陜西博森生物制藥有限公司，批號20099312)。甲鈷胺注射液(中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號396200652)；注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥六廠，批號0171909310)；GAP43 抗體(英國Abcam公司，貨號33-5000)；辣根過氧化酶標記的抗兔IgG抗體(英國Abcam公司，貨號ZB-2301)；免疫熒光二抗(美國Affinity公司，貨號S0017)。

1.3 儀器 16 cm全齒血管彎鉗(上海鑫閔生物科技有限公司)；石蠟切片機、超薄切片機(德國Leica公司)；分析天平、游標卡尺(北京第二精密量具廠)；Biolap98智能型生物信號系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 動物造模 以3.6%水合氯醛(10 mL/kg)沿兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔子呈俯臥位固定。依次備皮，消毒，鋪巾。從髂后上棘下縱行切開實驗兔左大腿后外側皮膚,逐層分離肌肉，找到并暴露坐骨神經(jīng),在距梨狀肌下緣約1.5 cm處用塑料膜覆蓋的16 cm全齒血管彎鉗的尖端鎖致全扣夾住神經(jīng)5 min，可見神經(jīng)纖維變薄但未離斷。在夾傷處神經(jīng)外膜用8-0顯微外科縫線做1標記，然后用3-0絲線逐層縫合皮膚，碘伏消毒，包扎傷口。術后繼續(xù)分籠專人飼養(yǎng)，術后連續(xù)3 d予注射青霉素鈉及碘伏消毒傷口預防感染，7 d后拆除縫線。

2.2 給藥與飼養(yǎng) 造模成功后，低劑量組予天麻素200 mg/kg，高劑量組予天麻素400 mg/kg，陽性藥組予肌注甲鈷胺注射液50 μg/kg，模型對照組予0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg。連續(xù)給藥4周，期間動物由專人喂養(yǎng)，喂養(yǎng)條件相同。

2.3 檢查方法與指標

2.3.1 大體觀察 術后每日觀察實驗兔的步態(tài)，傷口愈合情況，是否感染；是否出現(xiàn)自嗜現(xiàn)象；足趾與足底是否有潰瘍，肌肉萎縮情況。

2.3.2 坐骨神經(jīng)功能評分 ①趾張反射，提起實驗兔頸部皮膚，使其下落卻不著地。正常兔的反應為放射性腳趾打開，而坐骨神經(jīng)受損的表現(xiàn)則減弱甚至消失。以腳趾開合程度分級為1級, 腳趾完全沒分開；2級, 稍微分開；3級, 明顯分開, 但低于傷前水平；4級, 恢復至傷前水平，分別記1～4分。②改良Tarlov評分，0級, 肢體完全癱瘓, 對針刺無反應；1級, 針刺僅可見有輕微反應；2級, 損傷側后肢所有關節(jié)有自主運動, 但不存在抵抗能力；3級, 具有抵抗手壓能力, 步態(tài)仍不穩(wěn)；4級, 步態(tài)恢復至傷前水平，分別記0～4分。以上2項之和為每只實驗兔的坐骨神經(jīng)功能評分。

2.3.3 神經(jīng)傳導速度檢查 術后第1、2、3、4周將實驗兔麻醉后暴露患側坐骨神經(jīng)，使用Biolap98智能型生物信號顯示與處理系統(tǒng)進行電生理檢測，使用游標卡尺計算兩電極間的距離，記錄傳導時間，計算神經(jīng)傳導速度。

2.3.4 組織學檢查 術后第4周取實驗兔坐骨神經(jīng)鉗夾處神經(jīng)標本，進行常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE staining)，在光學顯微鏡下觀察病理情況及拍照。

2.3.5 靶肌肉恢復率 處死實驗兔后完整取下兩側小腿三頭肌并稱定質(zhì)量，計算其恢復率(恢復率=患側肌濕重/健側肌濕重×100%)。

2.3.6 神經(jīng)生長相關蛋白GAP-43的表達及累計吸光度 處死后取各組實驗兔坐骨神經(jīng)受損處橫斷面，按試劑盒說明書操作行GAP-43免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Plus 6.0進行累吸光度分析。

3 結果

3.1 大體觀察 手術過程中實驗兔因麻醉死亡3只，補齊后實驗順利。術后各組兔子未見明顯感染跡象。術后個別實驗兔傷口出現(xiàn)潰瘍情況，少部分出現(xiàn)自嗜現(xiàn)象。模型對照組實驗兔傷口處潰瘍較其余組大，自嗜現(xiàn)象更為嚴重。術后1周實驗兔肌力差，刺激無明顯反應，后肢拖地現(xiàn)象嚴重，四組之間未見明顯差異；術后第2周，模型對照組和低劑量組未見明顯好轉(zhuǎn)，高劑量組和陽性藥組實驗兔肌力有所恢復，偶見縮足與舔足行為，但仍有跛足現(xiàn)象；術后4周高劑量組和陽性藥組組實驗兔步態(tài)較前明顯好轉(zhuǎn)，手握其后腿感受后蹬力明顯強勁，刺激反應也更加明顯，見圖1～2。

圖1 術后1周開始模型對照組實驗兔出現(xiàn)嚴重的自嗜現(xiàn)象

注：模型對照組和低劑量組可見受損神經(jīng)菲薄，外膜出血現(xiàn)象仍明顯。高劑量組和陽性藥組可見受損神經(jīng)近乎正常形態(tài)，外膜血腫也基本消退，但仍然可見局部粘連。

3.2 坐骨神經(jīng)功能評分 本實驗根據(jù)趾張反射與改良Tarlov評分標準對各組實驗兔進行了客觀的評分及統(tǒng)計，計算出了坐骨神經(jīng)功能評分值，可見高劑量和陽性藥組評分在各個時間段均優(yōu)于模型對照組(P<0.05，P<0.01)，而低劑量組在各個時間段較模型對照組無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 不同時間點各組實驗兔的坐骨神經(jīng)指數(shù)

3.3 神經(jīng)傳導速度檢測 術后第1、2、3、4周分別將各組實驗兔麻醉后暴露患側坐骨神經(jīng)，以Biolap98生物信號系統(tǒng)進行神經(jīng)傳導速度檢測。結果顯示，在4個時間段，高劑量組和陽性藥組神經(jīng)傳導速度均大于模型對照組(P<0.05，P<0.01)，低劑量組與模型對照組比較無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 電生理統(tǒng)計圖

3.4 組織病理學檢查 術后4周取各組實驗兔左側坐骨神經(jīng)沿神經(jīng)長軸切片行HE染色，于光鏡下觀察顯示，高劑量組和陽性藥組神經(jīng)損傷處神經(jīng)纖維排列較整齊且致密，雪旺細胞增殖較多，模型對照組和低劑量組神經(jīng)纖維排列凌亂切疏松，且雪旺細胞較少，炎癥細胞較多，見圖3。

圖3 4周后處死實驗兔取得坐骨神經(jīng)行HE染色結果(×40，標尺50 μm)

3.5 靶肌肉恢復率 處死實驗兔后完整取下其兩側小腿三頭肌，計算其靶肌肉恢復率，得出高劑量組和陽性藥組恢復率均大于模型對照組(P<0.05)，低劑量組較模型對照組無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 靶肌肉恢復率

3.6 神經(jīng)生長相關蛋白GAP-43的表達水平及累計吸光度 4周后處死取各組實驗兔坐骨神經(jīng)受損處橫斷面，行GAP-43免疫熒光染色并進行累計吸光度分析，可見，高劑量組和陽性藥組組神經(jīng)生長相關蛋白GAP-43表達量遠多于模型對照組，低劑量組相較模型對照組卻無明顯差異。累計吸光度高劑量組和陽性藥組均高于模型對照組(P<0.05，P<0.01)，低劑量組對比模型對照組無明顯變化(P>0.05)，見圖4～5。

圖4 受損神經(jīng)橫斷面GAP-43免疫熒光染色(×100)

注：與模型對照組比較，#P<0.05,##P<0.01。

4 討論

神經(jīng)擠壓傷是臨床傷常見的致殘性疾病，常由外傷、腫瘤壓迫、炎癥等所致。本實驗所采取的神經(jīng)鉗夾傷是目前被廣泛認可且被應用的一種造模方法，很好地模擬了人周圍神經(jīng)擠壓傷的病理生理，主要表現(xiàn)為損傷后軸索斷裂，而神經(jīng)外膜，內(nèi)膜及束膜依舊保持著連續(xù)性，神經(jīng)傳導軸漿流經(jīng)過受損處時受阻，神經(jīng)傳導速度即下降[3]。隨后鈣離子聚集，激活相關的蛋白酶，導致受損部位髓鞘崩解，發(fā)生脫髓鞘反應。接著炎性細胞聚集，吞噬崩解產(chǎn)物[4]。起到關鍵因素的雪旺細胞開始增殖，它一方面協(xié)助吞噬細胞清理破裂的軸突碎片，另一方面形成為Bungner帶，為新生的軸突“搭橋”，同時還分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子[5]。然后，新生軸芽沿著Bungner帶通向靶器官，再次髓鞘化，神經(jīng)得到新生[6]。

天麻素為天麻的主要有效成分之一，被廣泛運用于治療頭痛、癲癇、頭暈等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]，在現(xiàn)代藥理學中，天麻素被證明了具有保護神經(jīng)元與抗氧化性損傷的功效[8-15]，同時能降低炎性因子的表達[16-19]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的運用中已較為廣泛。近年來在對周圍神經(jīng)損傷的研究中，天麻素被發(fā)現(xiàn)可以促進雪旺細胞的增殖[20]，還可以刺激腦源性生長因子的分泌[21]。甲鈷胺是現(xiàn)在臨床上常見的用于治療周圍神經(jīng)損傷的藥物，將其作為本實驗的陽性藥物作為對比。在正式實驗開始前本實驗組就天麻素的用量進行了預實驗，實驗分別設置了100、200、400、800 mg/kg梯度劑量組，結果顯示最低劑量組療效甚微，而最高劑量組出現(xiàn)了數(shù)只實驗兔精神狀況萎靡，進食差甚至死亡的情況，考慮為藥物濃度過大所致，因此本實驗天麻素選擇的劑量梯度為200、400 mg/kg。通過組織學染色發(fā)現(xiàn)天麻素高劑量組及陽性藥組受損神經(jīng)處炎性細胞浸潤較少，雪旺細胞增殖更甚及新生軸突較多且排列更致密；電生理是反應神經(jīng)功能恢復的客觀指標，其結果也同樣顯示高劑量組的神經(jīng)傳導速度較優(yōu)，這意味著受損部位的軸索得到了相對較好的修復；小腿三頭肌作為坐骨神經(jīng)的靶肌肉，其恢復率也表明支配其的坐骨神經(jīng)功能得到了改善；GAP-43作為周圍神經(jīng)損傷后再連接的標志性蛋白可以很好地反應神經(jīng)的修復與新生，天麻素高劑量組及陽性藥組的免疫熒光及吸光度皆優(yōu)于低劑量及模型對照組，意味著前者對受損神經(jīng)的再生起著良好的推動作用；同時也觀察到了隨著治療，高劑量組的實驗兔在行為學上的表現(xiàn)也有顯著的好轉(zhuǎn)。通過以上結果可以表明一定劑量的天麻素對損傷后多種因素的正向調(diào)節(jié)促進著神經(jīng)的修復。

本實驗證明了天麻素對實驗兔神經(jīng)擠壓傷的恢復具有積極意義，并且有著一定的量效關系。天麻素作為中藥提取物，有著不良反應小，吸收與代謝較快并且價格較為低廉的特點，相信隨著進一步的研究，這些特點可能會成為天麻素在治療周圍神經(jīng)損傷領域的優(yōu)勢所在。但是天麻素促進神經(jīng)修復地分子機制還尚不明確，這也是本課題組下一步會努力的方向。