骨寶丸對維甲酸誘導的骨質疏松小鼠OPG/RANKL通路的影響

區作明， 劉效仿， 李 雪， 陳 茹， 鄧向亮， 張念軍*

(1.廣州中醫藥大學附屬佛山市中醫院骨科,廣東 佛山 528000；2.佛山市高明區中醫院骨科,廣東 佛山 528500；3.南方醫科大學順德醫院中醫科,廣東 佛山 528300；4.廣東藥科大學中醫學院及附屬第二醫院,廣東 云浮 527300)

骨寶丸由熟地、仙茅、山萸肉等十多種中藥組成，具有補肝腎、強筋骨、健脾胃、益氣血的功效，是佛山市中醫院的院內制劑[1]。三十余年臨床應用結果表明骨寶丸對骨質疏松、骨折愈合遲緩、股骨頭無菌性壞死及肝腎虧損諸癥，均有較為理想的臨床療效[1-4]。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨骼系統疾病，常見于中老年人，特別是絕經后女性，隨著我國人口老齡化到來，預測我國骨質疏松患者約占世界50%[5-6]。骨質疏松形成的機制之一是骨吸收與骨形成之間的動態失衡，導致骨吸收大于骨形成，破壞了兩者共同維持的骨質及骨量的平衡。OPG/RANKL/RANK系統在骨吸收和骨形成的偶聯中起著關鍵性的作用，其中核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)與其配體RANKL(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)結合具有促進破骨細胞分化及骨吸收的形成的作用；而骨保護素(osteoprotegerin，OPG)則與RANK競爭性結合RANKL，從而抑制破骨細胞的分化和成熟，誘導破骨細胞凋亡[7-8]。骨寶丸治療骨質疏松療效顯著，但是其相關作用機制尚未完全清楚，本研究考察骨寶丸對骨質疏松小鼠OPG/RANKL通路的影響，從骨寶丸干預骨吸收的角度探討其潛在的作用機制，為其在臨床上進一步的推廣和使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性BALB/c小鼠30只，體質量(20±2)g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(粵)2013-0002，飼養于SPF級動物實驗室。

1.2 藥物 骨寶丸(粵藥制字Z20060052)由淫羊藿、龜板膠、鹿角膠、熟地、當歸、淮山藥、山茱萸肉、杜仲、川芎、黃芪、仙茅、紅參組成，上述藥材經清洗、烘干、粉碎后制備成糊丸(小丸)，小袋密封保存，每袋6 g。TLC檢測黃芪、熟地黃、當歸、川芎有效成分時，可作為該制劑質量控制標準[9]。

1.3 試劑與儀器 維甲酸(大連美侖生物科技有限公司)；免疫組化二抗試劑盒(美國Cell Signaling Technology公司)；兔來源的OPG和RANKL一抗、OPG ELISA Kit(北京博奧森生物技術有限公司)；RANKL ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司)。L535R型臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；Multiskan FC酶標儀(美國Thermo公司)；BX53型倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 分組、造模與給藥 小鼠隨機分為正常組、模型組及骨寶丸高劑量組(6 g/kg)、中劑量組(3 g/kg)、低劑量組(1.5 g/kg)，每組6只。除正常組外，其余小鼠灌胃給予維甲酸(100 mg/kg)，每天1次，連續30 d；骨寶丸各劑量組小鼠灌胃給予相應藥液(骨寶丸研磨成粉狀，加入水制成混懸液，劑量0.2 mL/10 g)，每天1次，連續30 d，按成人劑量的10倍劑量作為給藥中劑量(即3 g/kg)，同法得到高劑量(6 g/kg)、低劑量(1.5 g/kg)。

1.5 HE染色 將小鼠股骨置于10%中性甲醛溶液中固定48 h，脫鈣液脫鈣，制作股骨頭橫切面的石蠟切片，進行HE染色。

1.6 股骨生物力學檢測 將小鼠左側股骨用10%中性甲醛溶液固定，委托廣州元合生物科技有限公司進行三點彎曲實驗，檢測最大值載荷和最大值彎曲應力。

1.7 酶聯免疫吸附實驗 取小鼠外周血，離心分離血清，按照ELISA試劑盒方法檢測血清中OPG、RANKL水平。

1.8 免疫組化 按“1.5”項下方法處理小鼠股骨后制作石蠟切片，采用免疫組化法檢測骨組織OPG、RANKL分泌。為排除免疫組化的非特異性染色，設置陰性對照組，即采用磷酸鹽緩沖液代替一抗溶液與該組織孵育，其余操作同各實驗組。

2 結果

2.1 對小鼠股骨生物力學的影響 與正常組比較，模型組小鼠最大值彎曲應力(圖1A)、最大值載荷(圖1B)均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，骨寶丸各劑量組小鼠最大值彎曲應力、最大值載荷均有不同程度升高，以中、高劑量更明顯(P<0.05，P<0.01)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對小鼠股骨頭組織結構的影響 如圖2所示，模型組小鼠股骨頭體積縮小，骨髓腔明顯小于正常組，骨髓內容物減少，這與肉眼觀察到的股骨頭變小、股骨體色澤枯白的情況一致；與模型組比較，肉眼觀察到骨寶丸各劑量組小鼠股骨頭粗壯，其中高劑量組與正常組無顯著差異，股骨體顯現隱隱的紅潤光澤，而在顯微鏡下觀察骨寶丸各劑量組小鼠骨髓腔大于模型組，骨髓內容物增加。

圖2 小鼠股骨頭HE染色(×100)

2.3 對小鼠血清OPG、RANKL分泌的影響 如圖3A～3C所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中OPG水平較正常組有降低的趨勢，RANKL水平升高(P<0.01)，模型組小鼠OPG/RANKL比值降低(P<0.01)；與模型組比較，骨寶丸各劑量組小鼠血清RANKL水平降低(P<0.05)，而OPG水平較模型組有升高的趨勢，骨寶丸各劑量組小鼠OPG/RANKL比值升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 對小鼠股骨組織OPG、RANKL分泌的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠股骨組織OPG分泌減少，RANKL分泌增加；與模型組比較，骨寶丸高劑量組小鼠股骨組織OPG分泌增加，RANKL分泌減少。

注：紅色箭頭所指灰棕色處為組織分泌的OPG或RANKL。

3 討論

本研究結果表明骨寶丸可以拮抗維甲酸誘導的小鼠股骨最大值彎曲應力和最大值載荷減少以及骨髓組織微結構的改變，并且對小鼠血清和骨組織OPG/RANKL有調節作用。

骨質疏松的動物模型有多種造模方法，其中維甲酸造模具有簡便、成功率高、動物無死亡等優勢，因此本研究參考文獻[8]選用維甲酸誘導小鼠制備骨質疏松模型。骨質疏松會導致機體骨生物力學發生顯著改變，例如骨的最大值彎曲應力和最大值載荷降低，這也是骨質疏松患者容易出現骨折的重要原因。本研究發現骨寶丸顯著拮抗維甲酸誘導小鼠股骨的最大值彎曲應力和最大值載荷的降低，提示骨寶丸對小鼠骨質疏松有顯著防治作用。結果與文獻[8]報道骨寶丸顯著增加去除卵巢的骨質疏松大鼠脛骨的抗彎程度和彈性模量、剛性系數、韌性系數相一致。中醫理論認為“腎主骨生髓”，類似的補腎益精中藥阿膠補腎健骨方對去勢骨質疏松癥大鼠骨密度、最大載荷和最大值彎曲應力均有提高[10]，這提示骨寶丸治療骨質疏松與其“補腎”功能密切相關，而本研究的HE染色結果還顯示骨寶丸可以顯著增加骨質疏松小鼠骨髓內容物，該結果為上述觀點提供了支持。

為了進一步談探討骨寶丸防治骨質疏松的作用機制，考察了骨寶丸對維甲酸誘導骨質疏松小鼠OPG/RANKL的影響。結果顯示，維甲酸誘導的骨質疏松小鼠血清和骨組織RANKL分泌水平升高，而OPG在骨組織分泌水平降低、在血清中有下降的趨勢；同時OPG/RANKL的比值降低。骨寶丸干預可以明顯改善小鼠上述指標的變化，即對維甲酸誘導的骨質疏松小鼠OPG/RANKL通路有顯著調節作用。骨骼是一個高重建的器官，具有持續重塑周期，其中骨形成和骨吸收這組偶聯處于動態更新、共同維持骨質及骨量的平衡。研究表明OPG基因剔除的小鼠表現為破骨細胞分化活躍和骨吸收增強，出現嚴重骨質疏松[11-13]；RANKL可促進破骨細胞分化，增強成熟破骨細胞的活力，阻止破骨細胞凋亡，是破骨細胞分化的關鍵刺激因子，而RANK在破骨前體細胞或成熟破骨細胞表面高度表達，是目前發現的RANKL的唯一靶受體[14-15]。體內骨量的改變和體外破骨細胞的形成取決于RANKL與OPG的比值，即骨形成還是骨吸收，若OPG基因表達高于RANKL，則破骨細胞形成受抑制；相反，若OPG基因表達低于RANKL，則破骨細胞形成活躍[7]。因此，本實驗結果提示，骨寶丸防治骨質疏松的機制可能與其調節OPG/RANKL通路進而抑制過強的骨吸收相關。

綜合上述，本研究結果表明骨寶丸對維甲酸誘導的骨質疏松小鼠OPG/RANKL通路有調節作用，這可能是其防治骨質疏松的作用機制之一。