人參皂苷Rg3對UVB致抑郁模型大鼠行為學的影響

朱 爽， 姜 濤， 張洪長， 韓燕燕， 張 哲， 王恩鵬， 陳長寶

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

抑郁癥的特點是思維遲鈍、情緒低落、語言行動減少、缺乏活力和食欲不振等。隨著工作和生活的步伐加快，人類所受的壓力愈來愈大，抑郁癥的病發率逐漸上升。根據世界衛生組織預測，抑郁癥將列為疾病負擔的第二重病，僅次于心臟病[1]。目前公認的致病機制有單胺類神經遞質理論、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)理論、腦源性神經營養因子理論、免疫功能異常理論及氧化應激理論等[2-3]，其中前兩種假說已經得到廣泛認可，故本研究以兩種假說的常用指標5-羥色胺(5-HT)和皮質酮(CORT)作為判定抑郁癥的依據。紫外線是皮膚最常接觸的刺激源，過量照射產生的高濃度活性氧簇能夠引發氧化應激反應，從而導致皮膚損傷、機體免疫抑制、甚至皮膚癌[4]。最新研究表明，中波紫外線(ultraviolet B，UVB)輻射可導致HPA軸活化，降低海馬神經新生和突觸蛋白表達，并導致受照小鼠產生抑郁行為，而越來越多的證據表明，氧化應激產生的炎癥可能是誘發抑郁癥的重要因素[5-6]。

人參PanaxginsengC.A.Mey.為五加科植物，是我國珍貴滋補養生中藥，人參皂苷是其主要藥效成分，是一種固醇類化合物，含量在40.0%左右，主要成分包括人參皂苷Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等，有抗衰老、抗老年癡呆、抗心律失常、抗腫瘤、降血糖血脂、抑制細胞凋亡等功效[7]。通過文獻調研發現系統篩選人參皂苷抗抑郁活性成分的研究較少，因此本研究采用體外單胺氧化酶篩選人參中抗抑郁作用單體皂苷，建立UVB輻射抑郁大鼠模型，研究其活性成分對大鼠行為學及生化指標的影響。

1 材料

1.1 動物 40只SD雄性大鼠，體質量(180.0±10.0)g，購自長春生物制品有限公司動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK-(遼)2018-0001，飼養溫度20.0～25.0 ℃，相對濕度50.0%～60.0%，適應性飼養1周，期間飲食自由。

1.2 藥物與試劑 單胺氧化酶、氯吉蘭、犬尿胺二氫溴酸鹽(批號 SLBW9211、MKBW9449V、MKCF5310，美國 Sigma-Aldrich 公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(批號 20170429、20160806，分析純，北京化工廠有限責任公司)。人參皂苷Rg3、Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh2對照品(純度大于98%，吉林大學有機化學教研室)；5-HT、CORT酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批號 DG-050820R、DG-031538R，美國 R&D 公司)。

1.3 儀器 DK600B型保溫箱(上海森信儀器有限公司)；TCG16G型渦旋儀(上海安亭科學儀器廠)；Infinite M200PRO酶標儀(瑞士 Tecan 公司)；Eppendorf 5804R高速離心機(德國 Eppendorf 公司)；BT25S天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；-80 ℃超低溫冰箱MDF-U54 V[松下醫療器械(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 人參皂苷對單胺氧化酶A抑制活性測定 參考文獻[8-9]，優化反應條件，確立反應總體積為200 μL。分別向96孔酶標板中加入20 μL樣品、30 μL底物和130 μL PBS緩沖液，振蕩均勻，于37.0 ℃恒溫條件下反應10 min，加入20 μL的單胺氧化酶液(30 U/mL)，振蕩均勻，37.0 ℃恒溫環境下孵育40 min，立即檢測360 nm處的光密度值(OD)，平行試驗3次得平均值，即為OD樣品，空白孔(不加樣品，其他步驟相同)的光密度值為OD空白，背景孔(不加酶試劑和底物，其他步驟相同)的光密度值為OD背景，底物孔(不加酶試劑和樣品，其他步驟相同)的光密度值為OD底物。酶的活性范圍(OD底物-OD空白)等于ΔOD，最后以下述公式計算抑制率。

2.2 人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A抑制活性動力學研究

2.2.1 人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A結合可逆性分析 許多抑制劑通過形成一種抑制劑-酶復合物來抑制目標酶的活性，而此過程在含有大量抑制劑環境中會加速進行。為了分析抑制劑與單胺氧化酶A結合的可逆性，可將酶與高濃度抑制劑(人參皂苷Rg3或陽性對照藥物氯吉蘭)一起孵育，然后對酶-抑制劑復合物進行廣泛透析，恢復酶的活性，并分析比較透析前后其活性的變化。將5.0 μmol/mL人參皂苷Rg3與單胺氧化酶A一起孵育，總反應體系1.0 mL，37.0 ℃保溫40 min后，測定其在360 nm波長下光密度值。通過在冰上冷卻控制反應的終止，樣品保持在4 ℃下用PBS緩沖液透析14 h(更換3次)。空白組與陽性對照組進行同樣操作，透析前后測定酶活性，判斷抑制劑對單胺氧化酶A的抑制活性類型，即可逆性或非可逆性。

2.2.2 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A抑制活性類型 反應體積200 μL不變，固定反應體系中酶溶液的量，改變底物和樣品濃度，以底物濃度倒數(1/[S])為X軸、反應速率倒數(1/V)為Y軸，繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，判斷人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A可逆抑制類型，即競爭抑制、反競爭抑制、非競爭抑制或者是混合抑制。

2.3 人參皂苷Rg3對抑郁大鼠行為學及生化指標的影響

2.3.1 動物模型制備與分組 取雄性SD大鼠40只，體質量(180.0±20.0)g，禁食12 h稱定質量，用剃毛器剃除大鼠背部絨毛，間隔2 d剃除1次，實驗前隨機分為空白組，UVB模型組，人參皂苷Rg3低、高劑量組(40.0、80.0 mg/kg)，每組10只。UVB照射劑量和造模方法與文獻[10-11]類似，分別將模型組SD大鼠放于自制的盒子中，使其固定背部朝上，期間禁食禁水。給藥組在UVB照射前30 min給予藥液，模型組與空白組同時給予生理鹽水。UVB輻射時，大鼠背部距離光源30.0～42.0 cm，照射劑量每次366.0 mJ/cm2，持續照射5 d，第6天后，每2 d進行1次輻射，共14 d(10次)，總輻射劑量5.12 J/cm2。收集第14天空白組、UVB模型組及給藥組的血清樣品，于-80 ℃冰箱保存。

2.3.2 糖水偏好實驗 糖水偏好是快感缺失的評價指標。建模前實驗動物在安靜房間內適應含糖飲水。第1天給予大鼠兩瓶1.0%蔗糖水，第2天給予1瓶純水和1瓶1.0%蔗糖水，并在中間點更換兩瓶位置。禁食禁水24 h后，進行動物的基本自來水消耗試驗，每只大鼠給予預定量的1.0%蔗糖水和純水，大鼠自由飲水24 h，并在中間時間更換兩瓶位置。24 h后統計大鼠飲水情況。計算糖水偏好率并取平均值。糖水偏好率計算公式如下。

2.3.3 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗反應大鼠的絕望程度。制備圓柱形容器(直徑11.0 cm，高25.0 cm)，水深20.0 cm，水溫保持在(25.0±1.0)℃。將大鼠放于水中6 min，并記錄不動時間，不動標準為大鼠漂浮在水面，身體不掙扎。試驗結束后，用毛巾擦干大鼠的毛發，保持體溫，清洗漂浮在水面上的糞便。

2.3.4 血清5-HT和皮質酮水平測定 行為學測試后，進行大鼠眼眶取血，取血2.0 mL，在4 ℃血液冷卻后3 000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃保存，通過ELISA測定5-HT和CORT水平，嚴格遵循試劑盒說明書。

3 結果

3.1 人參皂苷的單胺氧化酶A抑制活性測定結果 單胺氧化酶是負責單胺神經遞質的代謝，影響大腦發育和功能的酶。由圖1可知，不同濃度的人參皂苷作用在相同濃度的酶和底物復合物中，人參皂苷Rg3具有較好的釋放底物，升高光密度的作用。從圖2可以看出，人參皂苷Rg3的IC50值為3.094 μmol/mL，對單胺氧化酶A具有較好的抑制效果。

圖1 不同濃度人參皂苷對單胺氧化酶A抑制作用

圖2 人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A抑制活性結果

3.2 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A抑制活性動力學研究結果

3.2.1 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A結合可逆性分析 采用透析法測定酶-抑制劑復合物的游離度，研究人參皂苷Rg3的結合特性。將高濃度的人參皂苷Rg3與單胺氧化酶A孵育40 min，將酶-抑制劑復合物混合物在4 ℃的緩沖溶液中進行透析，分析透析前后酶的活性(圖3)。在沒有抑制劑的情況下對單胺氧化酶A進行對照反應，結果顯示單胺氧化酶A在透析過程中喪失了約10.0%～15.0%的活性。5.0 μmol/mL的人參皂苷Rg3可以抑制95.0%以上的酶活性，透析后，超過70.0%的酶活性從酶-抑制劑復合物中恢復出來，這表明了人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A的抑制是可逆的，形成了可分離的酶抑制劑復合物。而陽性藥(氯吉蘭)的結果顯示了與單胺氧化酶A的可逆性結合。

注：與透析前比較，**P<0.01。

3.2.2 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A可逆抑制活性類型 通過改變底物和樣品濃度來研究人參皂苷Rg3對單胺氧化酶的抑制類型，結果(圖4)表明，人參皂苷Rg3的系列曲線交于Y軸，隨著抑制劑濃度的增加，Km增大，Vmax不變，表明人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A的的抑制類型屬于競爭性抑制[12-13]。

圖4 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A可逆抑制活性類型

3.3 糖水偏好實驗結果 如表1所示，輻射第14、21天，與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠糖水偏好均提高(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組大鼠糖水偏好比較

3.4 強迫游泳實驗結果 如表2所示，輻射第14、21天，與空白組比較，模型組大鼠不動時間延長(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠不動時間均縮短(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠強迫游泳不動時間比較

3.5 血清5-HT、皮質酮水平測定結果 由表3可知，與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT水平降低(P<0.01)，血清皮質酮水平升高(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠血清5-HT水平均升高(P<0.01)，血清皮質酮水平均降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清5-羥色胺和皮質酮表達的比較

4 討論

抑郁癥是一種以明顯而持久的情緒低落為主要特點的綜合性常見情感精神性疾病，早在我國古代文獻中多有記載，屬于中醫“郁證”范疇。雖然抑郁癥的單胺類神經遞質學說是目前較為公認的致病機制，但仍無法完全解釋抑郁癥的病理生理學機制。近年來，大量研究表明抑郁癥的發病率和HPA軸失調之間存在著一定的關系，而過度的應激刺激可能是引發抑郁癥的主要因素[14]。UVB輻射可刺激機體產生炎癥，并生成大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化應激反應。而氧化應激可導致HPA軸活化，通過下丘腦分泌促腎上腺皮質激素釋放激素，并刺激促進垂體前葉釋放促腎上腺皮質激素，使腎上腺內合成和釋放糖皮質激素，使血漿中糖皮質激素含量升高。糖皮質激素可以與海馬組織中的特異性受體結合，促進海馬神經細胞內立早基因的表達，作用于cAMP反應元件結合蛋白，抑制腦源性神經營養因子的生成，破壞海馬的神經可塑性，進而導致抑郁癥[15]。本實驗采用UVB輻射方法造模，與其他造模方法相比[16]，應激法可較好地模仿臨床抑郁患者的癥狀，且本實驗造模方法簡單易行、造模時間較短、成本低、實驗重復性及可控性較好。綜合以上實驗結果表明，使用的UVB輻射動物模型基本模擬了抑郁癥患者的情緒低落、快感缺乏、思維動作遲鈍等抑郁表現和體內單胺類神經遞質、HPA軸相關因子代謝異常等變化。

在行為學測試中，快感缺失和易產生絕望情緒反映了動物的抑郁樣行為，蔗糖偏好和強迫游泳實驗是行為學測試中的常用方法。糖水偏好率是快感缺失的主要指標，有研究指出，糖水飲用量的減少能夠反映動物的快感缺乏情況。強迫游泳實驗反映了動物在無法逃脫現有環境時的絕望狀態，通常以在水中不動時間表示，時間越長，動物越絕望。本研究中，人參皂苷Rg3灌胃可以提高模型大鼠糖水偏好率、縮短強迫游泳不動時間，說明人參皂苷Rg3有明顯的抗抑郁效果。在抑郁患者中，HPA軸過度活躍，而皮質酮是HPA軸的重要激素之一，它可以調節人體的代謝、認知和情緒，尤其對焦慮和抑郁作用明顯。5-HT是抑郁相關的神經遞質，當其水平不足時，會使中腦邊緣系統、網狀結構和低位腦干的中線區的神經元功能失調，從而出現抑郁癥狀。本研究中，人參皂苷Rg3治療可使模型大鼠血清中5-HT水平升高、CORT水平降低，表明人參皂苷Rg3對體內單胺類神經遞質和HPA軸具有一定的調節作用，這可能是改善UVB模型大鼠抑郁行為的作用機制之一。

綜上，本研究通過體外單胺氧化酶篩選出人參中抗抑郁作用單體皂苷Rg3，采用UVB連續照射建立抑郁動物模型，經行為學觀察及神經內分泌物質的檢測，證明該模型模擬了抑郁癥患者常見行為學表現及血清中5-HT水平降低和皮質酮水平增加等變化。給予人參皂苷Rg3組大鼠糖水偏好率增加、強迫游泳不動時間縮短、5-HT水平增加、皮質酮水平降低，表明人參皂苷Rg3有一定的抗抑郁效果，為繼續深入研究其作用機制提供了部分實驗依據。