青石止癢軟膏對特應性皮炎小鼠信號素3A/神經生長因子及相關信號分子的影響

鄧宇童 蔡玲玲 任雪雯 李雪 胡博 馮蕙裳 杭小涵 趙欣楠 于心薈 李元文

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種以濕疹樣皮疹、瘙癢、局部干燥等癥狀為特征的慢性、復發性、炎癥性皮膚病[1]。近年來，AD在中國的發病率增長迅速。目前相關研究發現，新生的表皮神經纖維與AD的發病關系密切[2-4]。表皮神經纖維的生長受到神經生長因子(nerve growth factor, NGF)和信號素3A(semaphorin3A,Sema3A)雙向調控，同時還有其他相關因子共同參與。當AD發病時皮膚屏障被破壞，表皮新生神經纖維密度增加，而通過調控Sema3A/NGF及相關分子水平，可以減少AD病患皮損部位新生表皮神經纖維的密度，減輕皮膚炎癥，改善AD臨床癥狀[5]。本團隊通過前期臨床觀察發現，應用青石止癢軟膏治療濕疹[6-8]、銀屑病[9-10]、神經性皮炎[11-14]及AD等炎癥性皮膚病療效顯著，相關作用機制研究有待完善。故本研究以不同濃度青石止癢軟膏干預2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorbenzene，DNCB)誘導的小鼠AD模型，觀察皮損癥狀評分、組織病理學改變、Sema3A/NGF及其相關信號分子表達的情況，從分子水平探討青石止癢軟膏治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/C小鼠56只，8周齡，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物質量合格證號：110324201103138756；實驗動物生產許可證號：SCKX(京)2019-0010。于北京中醫藥大學東方醫院SPF級動物房適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 實驗藥物、主要試劑及儀器

陽性對照試劑為丁酸氫化可的松(尤卓爾，天津藥業集團有限公司，批號：20061033)；陰性對照試劑為青石止癢軟膏所用基質軟膏，由北京中醫藥大學東方醫院皮膚科外治室制備，將橄欖油、蜂蠟按照10∶1配置而成；不同濃度青石止癢軟膏由北京中醫藥大學東方醫院皮膚科外治室制備，將青黛20 g、煅爐甘石60 g、煅石膏30 g、苦參30 g、黃柏30 g加8倍量70%乙醇，加熱回流提取，離心過濾，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮為1g生藥/mL提取液濃度的浸膏，冰片10 g趁熱加入濃縮液中混合均勻，悶潤30分鐘，過濾，蒸干后加入基質軟膏，配制含藥量不同的青石止癢高濃度軟膏(0.36 g/g)、中濃度軟膏(0.18 g/g)、低濃度軟膏(0.09 g/g)。

Trizol(美國Invitrogen公司，批號：326411)；氯仿、異丙醇(南京化學試劑有限公司，批號：20180907、2020120)、DEPC(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20210125)；cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(日本TaKaRa公司，批號：AJE1627A、AJE1687A)；rabbit Anti-GAPDH、羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20210121、20210115)；Rabbit Anti-Semaphorin 3A(美國abcam，批號：GR295523-1)；Rabbit Anti-PLPAK1(武漢三鷹，批號：00069245)；NGF、IL-31 ELISA試劑盒(美國Raybiotech，批號：409210572、521211755)；NT-4 ELISA試劑盒(美國RbD Systems，批號：0730210209)；H.E染色試劑盒、中性樹膠封片劑(北京中科萬邦生物科技有限公司，批號：RY-0002、FP-0001)；丙酮(北京化工廠，批號：20190801)；DNCB(天津光復精細化工研究所)；硫化鈉(福晨化學，批號：20190827)。

ST16R高速冷凍離心機(美國 Thermo Sorvall)；Spectramac M3多功能酶標儀(美國 MD)；XW-80A渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；熒光定量PCR循環儀、普通梯度PCR儀(美國ABI)；UV-2450紫外光度儀(日本 SHIMADZU)；電泳儀(美國 Bio-rad)；THZ-312臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)；G：BOXChemiXR5凝膠成像系統(英國 SYNGENE)；JT-12S脫水機、JB-P7包埋機(武漢俊杰電子有限公司)。

1.3 造模及分組

將56只小鼠適應性喂養1周后，全部予脫毛處理，脫毛方法為：用電推器及8%硫化鈉溶液對小鼠進行實驗部位脫毛，于腹部去毛，面積約為1 cm×2 cm，背部去毛面積約2 cm×3 cm。脫毛后，以隨機數字表法將56只小鼠隨機分為空白組8只，實驗組48只。結合參考文獻[15]及團隊相關實驗經驗[16]以DNCB丙酮溶液對實驗組小鼠進行特應性皮炎造模，造模方法略有調整，具體方法為：造模第一天，于腹部脫毛處涂7%的DNCB丙酮溶液致敏，3天后于同一位置進行第二次致敏；造模第8天，于背部涂0.5%的DNCB丙酮溶液進行激發，后每5天激發一次，連續激發6次。

造模成功后，再次以隨機數字表法將實驗組48只特應性皮炎模型小鼠隨機分為模型組、陽性對照組、陰性對照組、青石止癢高濃度組、青石止癢中濃度組、青石止癢低濃度組，每組8只。

1.4 干預方法

造模完成后，各組均予常規喂養。空白組、模型組不予任何干預措施；陽性對照組于背部皮損部位涂丁酸氫化可的松乳膏，每日2次；陰性對照組于背部皮損部位涂基質軟膏每日2次；青石止癢高、中、低濃度組于背部皮損部位涂分組對應濃度的青石止癢軟膏，每日2次。各組用藥參考指尖單位標準，每次用藥按照1指尖單位/2 cm2藥量外用，連續用藥7天。用藥期間若小鼠毛發生長則用4%硫化鈉溶液外涂補充脫毛。

1.5 皮損評分[17]

觀察記錄除空白組外各組小鼠皮損部位皮損評分，參考臨床特應性皮炎積分(scoring atopic dermatitis,SCORAD)指數標準，在取材前，對皮損嚴重程度進行評分：包括紅斑、鱗屑、水腫/丘疹、表皮剝脫，分為無(0分)、輕(1分)、中(2分)、重(3分)4個等級，各癥狀分級之間可記半級分數即0.5分、1.5分、2.5分。特應性皮炎總積分(表示小鼠AD嚴重程度)記為各項評分總和，區間為0～12分。

1.6 取材

藥物干預結束后1天，對小鼠予4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射進行麻醉，取實驗組背部造模部位皮膚及空白組同部位皮膚后予頸椎脫臼處死。將2 cm×1 cm大小皮膚組織于4%多聚甲醛中固定；將1 cm×1 cm大小皮膚組織3塊，分裝后于液氮速凍，置于-80℃冰箱凍存備用。

1.7 皮損病理切片觀察

取固定于4%多聚甲醛中的皮膚組織，進行常規脫水、包埋、切片等操作后，予HE染色。用全自動數字病理切片掃描儀對病理切片進行掃描，以K-Viewer軟件觀察皮損部位組織病理學變化。

1.8 皮膚組織勻漿檢測

取凍存于-80℃冰箱的皮膚組織進行相關分子檢測。

以實時熒光聚合酶鏈式擴增反應定量法檢測皮損中microRNA-145相對表達水平，從每組中隨機抽取4只小鼠的皮膚組織進行檢測。采用Trizol試劑提取皮損組織總RNA，測定濃度后制備cDNA進行反轉錄。擴增程序為：95℃，預變性5分鐘；共40個PCR循環(95℃變性15秒；60℃退火20秒；72℃延伸40秒)。熒光定量PCR循環儀進行定量，每個樣本基因做3個復孔；通過2-△△ct法計算microRNA-145相對表達量。microRNA-145引物序列：上游引物5′-CGCGATTCCTGGAAATACTG-3′,下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。U6序列：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，94bp。

以蛋白免疫印跡法檢測Sema3A、P21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)水平。對皮損組織蛋白提取、定量后，配置分離膠、濃縮膠每孔上樣適量(30 μg)蛋白，90V電泳后進行轉膜，轉膜結束后，取出NC膜并作好標記，用TBST洗膜5分鐘×3次后以5%脫脂奶封閉，搖床振蕩2小時。封閉后再次以TBST洗膜5分鐘×3次后將膜放入含一抗(Semaphorin 3A，1∶1 000；PLPAK1，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。吸棄一抗，洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫搖床振蕩反應2小時。ECL顯色后曝光、顯影。使用G：BOX chemiXR5成像。使用Gel-Pro32軟件對結果進行灰度分析。

以酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測白細胞介素31(interleukin-31，IL-31)、NGF、神經生長因子4(neurotrophin-4,NT-4)含量。采用BCA試劑盒檢測皮損組織細胞裂解液蛋白濃度，按照說明書完成操作后立即在酶標儀450 nm讀數。采用Sigmaplot 12.0軟件計算濃度值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 各組AD小鼠皮損表現及評分比較

取材前觀察各組小鼠背部皮膚情況，空白組小鼠未見皮損；模型組、陰性對照組小鼠皮膚存在不同程度的紅斑、鱗屑、表皮剝脫、抓痕、結痂等皮損；陽性對照組及青石止癢各濃度組，上述皮損較模型組、陰性對照組明顯減少。皮損評分結果顯示，治療后模型組與陰性對照組SCORAD評分無明顯統計學差異(P>0.05)；與模型組、陰性對照組相比，陽性對照組及青石止癢各濃度組SCORAD評分降低，皮損癥狀改善(P<0.05)；陽性對照組與青石止癢中濃度組相比，二者皮損評分無統計學差異(P>0.05)，青石止癢高、低濃度組皮損評分高于陽性對照組(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組AD小鼠SCORAD評分結果比較

2.2 各組AD小鼠皮膚組織病理學變化比較

空白組：角質層連續，角質形成細胞排列整齊，連接緊密，無明顯炎癥細胞浸潤；模型組：棘層、顆粒層增厚，可見角化過度及角化不全，真皮層有大量淋巴細胞浸潤，局部水腫明顯，提示慢性炎癥；陰性對照組：與模型組表現基本一致；陽性對照組：角質層較薄，偶可見角化過度，與模型組相比棘層變薄，少量炎癥細胞浸潤，角質形成細胞排列整齊，無明顯水腫；青石止癢各濃度組：與模型組相比棘層變薄，真皮層淋巴細胞浸潤減少，細胞間水腫較輕。見圖1。

2.3 各組AD小鼠皮膚組織microRNA-145表達水平比較

與空白組相比，治療后模型組、陰性對照組、青石止癢高、低濃度組的microRNA-145表達水平降低(P<0.05)；與模型組相比，青石止癢高、中濃度組的microRNA-145表達水平升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，青石止癢各濃度組microRNA-145表達水平無明顯統計學差異(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組AD小鼠皮膚組織microRNA-145表達水平比較

2.4 各組AD小鼠皮膚組織Sema3A、PAK蛋白表達水平比較

與空白組相比，治療后模型組、陰性對照組、青石止癢高、低濃度組皮膚Sema3A蛋白表達水平降低(P<0.05)，PAK蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組相比，陰性對照組在兩種蛋白表達水平上無統計學差異(P>0.05)；與模型組、陰性對照組相比較，陽性對照組、青石止癢中、低濃度組Sema3A蛋白表達水平升高(P<0.05)，PAK蛋白表達水平降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，青石止癢高濃度組PAK蛋白表達水平升高(P<0.05)，陽性對照組與青石止癢中、低濃度組的Sema3A蛋白、PAK蛋白表達水平無明顯統計學差異(P>0.05)。結果見圖2、表3。

注： A 空白組；B 模型組；C 陽性對照組；D 陰性對照組；E 青石止癢高濃度組；F 青石止癢中濃度組；G 青石止癢低濃度組。

注：A 空白組；B 模型組；C 青石止癢中濃度組；D 青石止癢高濃度組；E 青石止癢低濃度組；F 陰性對照組；G 陽性對照組。

表3 各組AD小鼠皮膚組織Sema3A、PAK蛋白表達比較

2.5 各組AD小鼠皮膚組織NGF、NT-4、IL-31含量比較

與空白組相比，治療后模型組、陰性對照組及青石止癢高濃度組皮膚NGF含量升高(P<0.05)，模型組NT-4含量升高(P<0.05)，模型組、陰性對照組IL-31含量升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、青石止癢各濃度組NGF、NT-4、IL-31含量均降低(P<0.05)，陰性對照組NT-4、IL-31含量降低(P<0.05)；與陽性對照組相比、陰性對照組，青石止癢高濃度組NGF含量升高(P<0.05)，陰性對照組、青石止癢低濃度組IL-31含量升高(P<0.05)，青石止癢中濃度組NGF、NT-4、IL-31含量與陽性對照組相比無顯著差異(P>0.05)。結果見表4。

表4 各組AD小鼠皮膚組織NGF、NT-4、IL-31含量比較

3 討論

AD作為皮膚科臨床常見疾病，其病因及發病機制復雜，至今未能明確。目前學界主要認為AD的發病原因是環境因素作用于遺傳易感性個體從而導致一系列免疫失調所致[18]，這與中醫“兩虛相得”的認識一致。青石止癢軟膏原名甘石青黛膏，源自已故名老中醫金起鳳教授經驗方，后經李元文教授[19]根據幾十年的臨床應用進行優化改良而得。方中重用爐甘石收濕止癢斂瘡為君；青黛瀉火解毒，涼血燥濕，與燥濕生肌的煅石膏相伍為臣；黃柏、苦參為佐以增強燥濕止癢之力；冰片解毒療瘡為使，諸藥合用共奏清肝瀉火，燥濕止癢之功。青石止癢軟膏現作為北京中醫藥大學東方醫院院內制劑被廣泛應用于辨證為濕熱證或肝郁化火證的炎癥性皮膚病，療效顯著。其治療AD的分子機制還有待完善。

本研究顯示，DNCB誘導造模后，模型組小鼠出現紅斑、鱗屑、表皮剝脫等皮損，組織病理學可見真皮層有大量淋巴細胞浸潤，局部水腫明顯棘層、顆粒層增厚，角化過度及角化不全的表現，提示造模成功。用藥7天后，青石止癢各濃度組以及陽性對照組在皮損評分與組織病理學表現上較模型組明顯改善，提示青石止癢軟膏對AD療效明確。

研究發現，神經內分泌—免疫—皮膚系統下屬的神經營養因子家族所包含的NGF、腦源性神經因子、神經生長因子3及NT-4等因子在促進神經生長方面扮演重要角色，是神經元和角質形成細胞的生長因子，具有抗凋亡、參與神經遞質的釋放以及調控皮膚炎癥的作用[20-21]。而同樣由角質形成細胞表達的Sema3A作為神經排斥因子，則具有抑制神經生長的作用，與NGF等因子共同支配表皮神經纖維的生長，起到雙向調節的作用。有研究發現，當皮膚屏障破壞后，表皮神經正常生長受影響，表現為表皮神經的密度增加[22]。相關研究已發現，在患有AD的人類[23-25]和小鼠皮膚活檢[26]中觀察到NGF高于正常表皮表達，其他因子如NT-4在AD患者中表達也有增加[27]，與之相對的Sema3A的表達則會減少[28]。應用神經生長因子抑制劑[29]或Sema3A軟膏[30]可以有效干預AD的發展，其他干預手段也可以通過對Sema3A/NGF相關分子水平產生影響從而治療AD[31-32]。

本研究顯示，陽性對照組以及青石止癢中、低濃度組Sema3A表達水平高于模型組；陽性對照組、青石止癢各濃度組NGF、NT-4含量低于模型組。而與空白組比較，青石止癢高、低濃度組分子水平上仍存在差異，未恢復到正常水平，提示不同濃度藥物治療效果可能存在差異，考慮可能與藥膏濃度、透皮吸收度以及療程等因素相關，具體還需進一步研究。

此外本研究結果顯示，與空白組相比，模型組microRNA-145表達降低，PAK表達增多，IL-31含量增加；經7天用藥后，陽性對照組及青石止癢中濃度組microRNA-145表達上調，PAK表達減少，陽性對照組及青石止癢各濃度組IL-31含量減少，與空白組相比無顯著差異。microRNA-145是調控Sema3A蛋白基因表達的重要靶向micro RNA，當microRNA-145上調時，mRNA以及蛋白質水平上的Sema3A都會出現過度表達[33]。PAK是Rac1的效應結合蛋白，有研究表明PAK對Sema3A及其誘導的神經塌陷反應有一定的抑制作用[34]，因此推測其可能與AD有潛在聯系。除此之外，還有許多因子可能影響到AD患者表皮神經纖維的生長。有研究報道AD患者皮膚瘙癢部位的IL-31含量高于正常皮膚[35]，這可能與IL-31誘導神經元的生長，從而導致皮損部位神經密度增加有關[36]。有研究也證實了抗IL-31可顯著抑制AD小鼠模型的瘙癢癥狀[37]。

綜上，青石止癢軟膏一方面可以改善AD皮損癥狀以及組織病理學變化，另一方面在分子層面，可能是通過降低NGF、NT-4的水平，并通過增強microRNA-145基因表達，從而提高Sema3A蛋白表達水平，同時抑制PAK蛋白表達，從而降低皮損部位新生表皮神經纖維密度，對AD起到積極的治療作用。此外，青石止癢軟膏還可以通過降低皮損部位IL-31分子水平，進一步減少新生表皮神經纖維對皮損部位的影響。