電針干預對肌萎縮側索硬化SOD1 G93A轉基因小鼠脊髓SOD1、GSH-Px含量和Bax、Bcl2表達的影響

孫嫘 韓敏娟 李娜 劉娟 喬海法

肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種神經退行性疾病，以上、下運動神經元選擇性損害為特征，平均生存率為3.5年[1]。調查顯示，中國ALS患病率約為3.1/10萬人[2]。目前，僅利魯唑對ALS有暫時緩解作用[3]。ALS患者相關基因突變或通路異常表達，動態平衡破壞而導致體內氧自由基累積，引起氧化應激反應，導致ALS運動神經元的進行性損傷及丟失。肌萎縮側索硬化SOD1 G93A轉基因小鼠(SOD1 G93A transgenic mice，SOD1G93A)與人類ALS 發病特點極為相似，該鼠從胚胎發育后期已出現神經退行性變[4]，同時客觀反映了氧化應激對運動神經元的損傷機制，為研究提供可靠的動物模型[5]。故本研究采用 SOD1G93A轉基因小鼠為實驗對象，通過電針干預雙側足三里穴、曲池穴，觀察小鼠體質量、轉棒實驗潛伏期的改變，檢測脊髓組織銅鋅超氧化物歧化酶(Cu, Zn-Superoxide dismutase，SOD1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的含量，以及B淋巴細胞瘤基因-2相關X蛋白(BCL2-Associated X，Bax)和B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl2)的表達，探討電針干預調控脊髓抗氧化酶水平以及抗細胞凋亡水平，從而保護神經元，改善ALS運動功能及癥狀，提高存活率的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SOD1G93A轉基因小鼠24只，同窩陰性小鼠12只，12周齡，體質量(20±3) g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，合格證編號：SCXK(蘇)2016-0010。動物實驗過程嚴格遵守國家實驗動物管理條例規定，所有SOD1G93A轉基因鼠均飼養于明暗交替(12小時/12小時)、恒溫(25±2)℃、恒濕(50%～70%)、無特定病原菌(specific pathogen free, SPF)環境中，以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料和無菌水飼養。

1.2 實驗試劑與儀器

一次性無菌針灸針(0.30 mm×15 mm，蘇州醫療用品廠有限公司)；SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司) ；小鼠固定器(眾實科技，批號：1056714)。SOD1測定試劑盒(南京建成，批號：A001-2-2)；GSH-Px試劑盒(南京建成，批號：A005-1-1)；Anti-Bcl-2 (北京博奧森，批號：bs-4563R)；Anti-Bax(北京博奧森，批號：bs-0127M)；山羊抗鼠IgG(北京鼎國昌盛，批號：SH-0011)。PVDF轉印膜(美國Thermo Fisher公司)；石蠟切片機(德國SLEE公司)；顯微鏡(日本OLTMPUS公司) ；電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.3 分組與干預方法

SOD1G93A轉基因小鼠24只按照對照隨機數字表法分為電針組、模型組，每組12只，同窩陰性小鼠12只作為空白組。根據《常見實驗動物穴位圖譜》足三里穴定位：在膝關節外側、腓骨小頭下3.5 mm，直刺2 mm；曲池穴定位：位于橈骨近端的關節外側前方的凹陷中，直刺2毫米。電針組針刺雙側足三里穴、曲池穴后，采用1 mA，2 Hz斷續波，持續刺激1分鐘，后留針15分鐘，不作任何手法；空白組及模型組采取同樣抓取手法并固定15分鐘。三組均于每日上午干預1次，每周5次，周六、周日不予針刺，連續干預4周。

1.4 觀測指標及檢測方法

1.4.1 體質量 SOD1G93A轉基因小鼠早期體質量下降主要是由于運動神經元的丟失導致肌肉萎縮而致。3組小鼠分別于干預前1天及干預1周、2周、3周、4周末干預結束后進行體質量測量，每只測量3次，取平均值[6]。

1.4.2 轉棒實驗 也稱潛伏期，主要觀察小鼠在轉棒儀器上停留時間，用于評定小鼠協調性及肌力。轉棒儀轉速為15 r/min，超過200秒按照200秒記錄，不足200秒則按照實際時長記錄。實驗前對小鼠進行1周適應性訓練。測試時間為干預前1天及干預1周、2周、3周、4周末干預結束后，記錄小鼠每次潛伏期的時間，每只小鼠重復測量3次，每次間隔15分鐘，取平均值。

1.4.3 取材與檢測 三組小鼠完成最后1次干預、測量體質量，并禁食24小時(正常飲水)后，每組隨機取6只使用冰PBS和4%多聚甲醛進行小鼠全身固定灌流，取脊髓腰4～5節段組織置于4%多聚甲醛后固定。采用免疫組化法，觀察SOD1G93A轉基因小鼠脊髓組織Bax、Bcl2陽性細胞表達。每組剩余6只小鼠予10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉，斷頭處死，于冰塊上迅速剪取脊髓腰4～5節段組織，放入凍存管中，并保存于-80℃的冰箱備用。利用比色法，檢測SOD1G93A轉基因小鼠脊髓組織 SOD1、GSH-Px的含量。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 電針干預對ALS小鼠體質量的影響

干預期間，空白組體質量呈增加趨勢；電針組較模型組減輕幅度小，但均較空白組體質量明顯減輕，差異具有統計學意義(P<0.05)。說明電針干預后，SOD1G93A轉基因小鼠體質量得到了一定的保持或增加，因運動神經元的丟失而導致的肌肉萎縮得到了一定的改善。見表1。

表1 各組ALS小鼠電針干預前后體質量比較

2.2 電針干預對ALS小鼠潛伏期的影響

模型組、電針組較空白組潛伏期均縮短(P<0.05)；電針組較模型組停留時間長，差異具有統計學意義(P<0.05)。說明電針干預后，SOD1G93A轉基因小鼠運動功能得到一定的改善。見表2。

表2 各組ALS小鼠電針干預前后轉棒實驗潛伏期比較

2.3 電針干預對ALS小鼠脊髓組織SOD1、GSH-Px含量的影響

與模型組相比，電針組SOD1、GSH-Px表達明顯升高(P<0.05)，但仍顯著低于空白組(P<0.05)。表明電針干預可能通過增加SOD1、GSH-Px的表達，抗氧化應激，抑制神經元進一步損傷，進而改善SOD1G93A轉基因小鼠疾病的狀態。見表3。

表3 各組ALS小鼠電針干預前后脊髓組織SOD1、GSH-Px含量的比較

2.4 電針干預對ALS小鼠脊髓組織Bax、Bcl-2表達的影響

干預結束后，Bax 在各組小鼠脊髓中均有表達。與空白組相比，模型組與電針組Bax陽性細胞計數均明顯升高，平均灰度值降低 (P<0.05)，表明SOD1G93A小鼠脊髓腰4～5節段中細胞凋亡相關酶增多。與模型組相比，電針組脊髓中Bax 陽性表達降低，平均灰度值增高(P<0.05)。同時，電針干預4周后出現脊髓中抗細胞凋亡基因Bcl-2 增加的現象(如圖2)，表明各組小鼠Bcl-2 在脊髓中均有表達。與空白組相比，模型組與電針組Bcl-2 陽性細胞計數均明顯降低，平均灰度值升高(P<0.05)，表明SOD1G93A小鼠抗細胞凋亡基因減少。與模型組相比，電針組Bcl-2 陽性表達增高，平均灰度值降低(P<0.05)，表明電針干預可能通過降低Bax的表達，升高Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡，改善SOD1G93A轉基因小鼠疾病的狀態。(見圖1、圖2)

3 討論

中醫古籍無ALS的相關記載，大多數醫家以其進行性的肌無力、肌萎縮等主要臨床表現，將其歸入“痿病”的范疇。《素問·痿論篇》:“論言治痿者，獨取陽明何也?”《靈樞·根結》曰:“太陽為開，陽明為闔，少陽為樞……故痿疾者，取之陽明。”張介賓云：“陽明虛則血氣少，不能潤養宗筋……故足痿為用，此所以當治陽明也。”可見“治痿獨取陽明”理論是針灸治療痿證的核心內容之一。歷代醫家無不以此為治療痿證之理論，遣方用針之臨床指南。在此理論基礎之上，應用針灸方法治療運動神經元病，如ALS等，取得了一定的臨床療效。臨床實踐證明，針刺以陽明經足三里、曲池為主穴，具有通經絡、益脾胃、強筋骨、潤肌肉之功效[7-9]。本實驗即以“治痿獨取陽明”為理論基礎，取雙側足三里穴、曲池穴，以電針代替人工手法操作，減少人為操作的誤差。

現代醫學認為ALS的發病與多種因素有關，而氧化應激是主要發病因素之一。在ALS患者尸檢中發現脊髓和大腦運動皮層中羰基衍生物水平明顯升高，提示ALS患者神經系統中存在氨基酸的直接氧化[10]。正常人體內會不斷產生和消除各類活性氧基團，而ALS患者由于基因突變等因素導致體內自由基過度積累，同時抗氧化系統清除能力下降，從而引起氧化應激反應[11]。中樞系統所含抗氧化物總量相對不足，耗氧量高，細胞膜含有大量不飽和脂肪酸及具有氧化還原活性金屬離子，在發生氧化應激時，神經細胞易首先受到損傷，從而引起ALS的各種癥狀[12]。SOD1占SOD總量的86%，是生物內源性抗氧化劑，可通過歧化作用清除體內超氧陰離子自由基， 減輕細胞損傷， 在維持細胞膜的結構和功能中起著十分關鍵的作用[13-14]。而GSH-Px作為活性過氧化氫的清除劑，可加強SOD1保護細胞膜結構和功能完整的作用[15]。實驗結果表明，與空白組相比，模型組小鼠體質量明顯降低，潛伏期也明顯縮短，同時脊髓組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px的表達明顯偏低，說明SOD1G93A轉基因小鼠隨著發病時間的進展，體內確實存在氧化應激。電針干預可顯著提高SOD1、GSH-Px的含量，使失衡的氧化/抗氧化酶系統趨于正常，從而減輕氧化損傷，保護神經元。Bax、Bcl-2是一對凋亡與抗凋亡的基因表達的蛋白，共屬Bac-2基因家族。Bcl-2與Bax蛋白水平的高低與凋亡調控直接相關，Bcl-2是細胞凋亡的抑制基因，而Bax拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，且具有促進細胞凋亡的功能。Bax與Bcl-2共存于線粒體，Bcl-2與Bax蛋白可形成同二聚體，也可相互作用形成異二聚體。其中，Bax自身可組成同二聚體，而Bcl-2必須結合Bax形成異二聚體，從而阻抑凋亡[16]。Bcl-2基因所編碼的蛋白質屬于胞內膜整合蛋白，它對大多數因素誘導的細胞凋亡具有拮抗作用。而Bcl-2蛋白能夠影響活性氧水平，可有效清除氧自由基，減輕細胞的損傷[17-18]。同時Bcl-2能促進谷胱甘肽進入核內，改變核內氧化還原狀態，從而抑制凋亡[19-20]。電針干預足三里穴和曲池穴可使Bax表達降低、Bcl-2表達升高，提高了脊髓組織抗細胞凋亡能力，從而減少神經元的凋亡。

注：A 空白組;B 模型組;C 電針組

注：A 空白組;B 模型組;C 電針組

綜上所述，電針干預足三里穴和曲池穴可改善SOD1G93A轉基因小鼠的運動功能，提高脊髓組織對活性氧誘導神經細胞凋亡的負性調節作用，抑制神經元的凋亡，從而有效發揮對神經元的保護作用，減少神經元損傷，起到早期治療ALS的效果，對ALS早期臨床防治具有重要意義。