高效液相色譜- 串聯質譜法（HPLC-MS） 測定苦丁茶中的孔雀石綠和隱色孔雀石綠

蔣 雨， 兌靖冬， 范志平

（ 宜賓市食品藥品檢驗檢測中心， 四川 宜賓 644000）

孔雀石綠是一種合成的三苯基甲烷類工業染料，在水產養殖業中用作殺蟲劑和預防水霉劑[1-2]。 由于孔雀石綠殘留時間長， 并有致突變、 致畸和致癌的危險性[3-5]， 因此中國、 美國、 加拿大等許多國家均禁止將其作為人類食用魚的獸藥使用[6]。 2002 年9 月實施的農業行業標準NY 5071—2002 中明確規定孔雀石綠為禁用漁藥[7]。 《 農業農村部公告第250 號》明確規定， 孔雀石綠屬于食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物[8]。 在近年來區縣市場監管部門的委托送檢中， 陸續在苦丁茶中檢出了孔雀石綠及其代謝物成分。 但是， 國家現有標準中涉及孔雀石綠項目檢測的品種主要有養殖水體、 飼料和水產品； 在已發表的論文中也僅有水體、 水產品及淀粉制品中孔雀石綠殘留量的檢測， 沒有苦丁茶中孔雀石綠及其代謝物的測定方法。 因此， 建立苦丁茶中孔雀石綠及其代謝產物的檢驗方法很有必要。

1 材料與方法

1.1 耗材與試劑

中性氧化鋁柱（1 g/3 mL） ， 上海安譜實驗科技股份有限公司提供； 乙腈（色譜純）， 山東禹王實業有限公司提供； 乙酸銨（ 分析純） ； 孔雀石綠-D5 對照品 （ 232342， 100%） ； 隱 色 孔 雀 石 綠 對 照 品（ 00209， 97.0%） ； 隱 色 孔 雀 石 綠-D6 對 照 品（212023， 100%）； 苦丁茶樣品為抽檢樣品。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200 HPLC-6410 Triple Quad LC/MS，Agilent 公司產品； CP225D 型萬分之一電子天平，Sartorius 公司產品； ULUP-Ⅱ-10T 型超純水機， 成都超純科技有限公司產品； KQ-700DE 型數控超聲儀。

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18（ 2.1 mm×30 mm，3.5 μm） 色譜 柱， 流動相為乙腈（ 0.1%甲酸）-5 mmol/L 乙酸銨溶液（ pH 值4.5） （ 70∶30） ， 流速為1.0 mL/min， 進樣量為10 μL， 柱溫為35 ℃，采集時間5 min 。

1.2.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源， 采用正離子模式監測，霧 化 氣 體， N2； 霧 化 器 壓 力 為30 Psi， 干 燥 氣 體：N2， 溫度為350 ℃， 流速為9 L/min； 毛細管電壓為4 000 V， 采用多重反應監測模式（MRM）。

1.3 方法

樣品處理方法： 苦丁茶樣品粉碎， 混勻， 稱取約1 g 粉碎樣品于25 mL 容量瓶中， 精密加入400 L 混合內標工作溶液， 加入適量乙腈， 超聲提取20 min后， 用乙腈定容至25 mL， 搖勻， 轉移至50 mL 離心管， 以轉速4 000 r/min 離心5 min， 備用。 移取5.00 mL 上清液至已活化的中性氧化鋁上， 用試管接收流出液， 4 mL 乙腈洗滌中性氧化鋁柱， 收集全部流出液， 45 ℃下氮吹至約1 mL， 殘液用乙腈定容至1.0 mL， 超聲處理5 min， 加入1.0 mL 5 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 值4.5） ， 超聲溶解1 min， 樣液經0.22 μm濾膜后， 立即用HPLC-MS 測定。

對照品溶液的制備方法： 精密稱取孔雀石綠、孔雀石綠-D5、 隱色孔雀石綠、 隱色孔雀石綠-D6各約10 mg， 分別置100 mL 容量瓶中， 用乙腈溶解并定容至100 mL， 配制成質量濃度分別為100 μg/mL的標準貯備液（-18 ℃下避光保存） 。 混合標準工作溶液： 精密吸取孔雀石綠、 隱色孔雀石綠標準貯備液各0.1 mL 于同一100 mL 容量瓶中， 用乙腈定容至刻度， 配制成質量濃度約為0.1 g/mL 的混合標準工作溶液。 混合內標工作溶液： 精密吸取2 種氘代內標貯備液各0.1 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度， 配制成濃度約為0.1 g/mL 的混合內標工作溶液。 取混合標準工作溶液與混合內標工作溶液適量， 用乙腈+5 mmol/L 乙酸銨溶液（1+1）稀釋成質量濃度分別為1， 2， 5， 10， 20， 50 μg/L，內標質量濃度為4 μg/L 的對照品溶液。

2 結果與分析

2.1 線性范圍

取質量濃度為1， 2， 5， 10， 20， 50 μg/L， 內標濃度為4 μg/L 的對照品溶液10 μL， 在“ 1.2.1”項下的色譜質譜條件下進樣， 記錄定量子離子峰面積。 以待測組分定量子離子峰面積與內標定量子離子峰面積的比值（Y） 對待測組分對照品溶液質量濃度（X） 進行線性回歸， 得到回歸方程、 相關系數和線性范圍。

孔雀石綠Y=0.305 8X+0.097 1（R=0.999 8）

隱色孔雀石綠Y=0.971 7X-0.907 2（R=0.999 5）

結果表明， 孔雀石綠1.088～54.400 μg/L， 隱色孔雀石綠1.056～52.800 μg/L 質量濃度范圍內， 組分定量子離子峰面積與內標定量子離子峰面積比值的線性關系良好。

2.2 回收率的測定

取均質空白茶葉試樣1 g， 置于25 mL 量瓶中，分別添加混合標準工作溶液500 μL（ 即添加量約為50 μg/kg）， 按“ 1.3” 項下的方法制備并測定含量， 計算回收率， 結果2 組分的平均回收率分別為89.16%，94.44%； RSD 分別為9.41%， 3.39%。

2.3 檢出限、 定量限的測定

在空白茶葉樣品中添加孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合標準工作溶液， 以信噪比（ S/N） 等于3 為檢出限標準； 以信噪比（S/N） 等于10 為定量限標準， 測定2 個待測組分的方法檢出限和定量限。 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的檢出限分別為0.40 μg/kg與2.5 μg/kg； 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的定量限分別為1.3 μg/kg 與8.3 μg/kg。

孔雀石綠、 隱色孔雀石綠的總離子流圖見圖1，孔雀石綠、 隱色孔雀石綠、 孔雀石綠-D5、 隱色孔雀石綠-D6 的提取離子流圖見圖2。

圖1 孔雀石綠、 隱色孔雀石綠的總離子流圖

圖2 孔雀石綠、 隱色孔雀石綠、 孔雀石綠-D5、 隱色孔雀石綠-D6 的提取離子流圖

2.4 樣品測定

對抽檢的5 份樣品進行了檢測， 總含量最高為5.87×103μg/kg， 最低為20.9 μg/kg。

樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠檢測結果見表1。

表1 樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠檢測結果/μg·kg-1

3 結論

孔雀石綠在1.088～54.400 μg/L， 隱色孔雀石綠1.056～52.800 μg/L 質量濃度范圍內， 線性關系良好（R＞0.999） 。 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的檢出限分別為0.40 μg/kg 與2.50 μg/kg， 平均回收率為91.82%～106.70%， RSD≤12.6%。 用該方法檢測抽檢樣品，5 份陽性樣品總含量最高達5.87×103μg/kg。 從檢測結果來看， 市場上確有苦丁茶中非法添加孔雀石綠及其代謝產物的情況， 加強苦丁茶中孔雀石綠檢測方法建立， 對其進行有效檢測， 對于保證食品安全、促進國民健康及社會經濟發展具有重大意義。