蔬菜水果中藜蘆堿殘留量檢測方法的研究

李 娜， 張碧宇， 陳鑫蘭， 隋玉杰

（1. 浙江義譜檢驗檢測技術(shù)服務(wù)有限公司， 浙江 溫州 325000；2. 溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測科學(xué)研究院， 浙江 溫州 325000； 3. 溫州市食品藥品檢驗科學(xué)研究院， 浙江 溫州 325028）

0 引言

藜蘆生物堿（Veratrine） 是一種以藜蘆定（Veratrdine） 、 藜 蘆 胺 （ Veratramine） 和 蒜 藜 蘆 堿（Jervine） 為主的混合生物堿， 提取自我國盛產(chǎn)的百合科多年生草本植物藜蘆， 其作用機(jī)制與氯化煙酰類農(nóng)藥相似， 具有觸殺和毒胃作用， 對昆蟲類害蟲有一定的抑制生長和滅殺作用， 可防治棉蚜、 玉米螟、 水稻潛葉蠅、 柑橘葉螨等多種作物害蟲。 藜蘆堿提取于自然植物， 一般認(rèn)為環(huán)境相容性較好， 近年來在蔬菜水果農(nóng)藥中的應(yīng)用逐漸廣泛， 藜蘆堿的登記數(shù)量與產(chǎn)量也不斷增加。 雖然藜蘆堿是一種植物源殺蟲劑， 但對人的神經(jīng)系統(tǒng)、 呼吸系統(tǒng)、 心血管系統(tǒng)、 消化系統(tǒng)、 生殖系統(tǒng)都有一定的毒性作用，嚴(yán)重時可引發(fā)痙攣抽搐、 呼吸暫停、 心律失常， 胚胎畸形等。 目前， 在食品領(lǐng)域還未出臺相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)， 但在化妝品領(lǐng)域已經(jīng)在《 化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 版） 中將藜蘆堿及其鹽類列入了禁用名單[1]。

采用超高效液相色譜- 質(zhì)譜/ 質(zhì)譜聯(lián)用法（ UPLC-MS/MS） 檢測蔬菜水果中藜蘆堿殘留量， 通過對不同蔬菜水果中藜蘆堿的萃取溶劑、 提取方法、凈化方法及色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行研究， 確定前處理方法及儀器方法， 建立一個操作性強(qiáng)、 適應(yīng)性廣、 檢測效率高的檢測方法， 準(zhǔn)確評價蔬菜水果中藜蘆堿殘留量的含量， 并對溫州地區(qū)市售不同蔬菜水果進(jìn)行檢測，達(dá)到有效監(jiān)管， 從而更好地維護(hù)消費(fèi)者的健康。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

藜蘆定（ Veratridine， 71-62-5， 99.7%） ， 藜蘆胺（ Veratramine， 60-70-80， 100%） ， 蒜 藜 蘆 堿（ 469-59-0， Jervine， 98.5%） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 德國Dr.Ehrenstorfer 公司提供； 乙酸乙酯、 正己烷、 乙腈、甲酸、 無水乙醇均為色譜純； 試驗用水為超純水。

超高效液相色譜- 質(zhì)譜/ 質(zhì)譜聯(lián)用（ UPLCMS/MS） ； GCB/NH2SPE 固相萃取柱， 500 mg， 6 mL，上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司產(chǎn)品； Florisil SPE固相萃取柱1 g， 6 mL， 上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司產(chǎn)品； QuECHERS Clean-up Kit， 900 mg MgSO4+150 mg PSA+15 mg GCB， 15mL， 北京隆年達(dá)信科貿(mào)有限公司產(chǎn)品； 5430R 型高速冷凍離心機(jī)， 德國Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗樣品及試驗條件

1.2.1 試驗樣品

蘋果、 梨、 橘子、 青菜、 青椒等均為市售的水果蔬菜。

1.2.2 QuEChERS 前處理方法[2]

稱取10 g 試樣， 精確至0.01 g， 置于50 mL 離心管中， 加入10 mL 乙腈、 4 g 硫酸鎂、 1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉、 0.5 g 檸檬酸氫二鈉， 均質(zhì)1 min 后以轉(zhuǎn)速4 200 r/min 離心5 min， 吸取6 mL 上清液加到裝有900 mg 硫酸鎂及150 mg PSA 的15 mL 塑料離心管中： 對于顏色比較深的試樣在15 mL 離心管中加入885 mg 硫酸鎂、 150 mg PSA 及15 mg GCB， 旋渦混勻1 min。 以轉(zhuǎn)速4 200 r/min 離心5 min， 準(zhǔn)確移取上清液2 mL 于10 mL 離心管中， 40 ℃下水浴氮吹至近干， 加入甲醇1 mL 復(fù)溶， 過0.22 μm 濾膜， 待儀器進(jìn)樣測定。

1.3 樣品的制備

水果、 蔬菜樣品取樣部位按GB 2763 附錄A 執(zhí)行， 將樣品切碎混勻均一化制成勻漿， 制備好的試樣均分成2 份， 裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)， 密封并標(biāo)明標(biāo)記。 將試樣于-18 ℃冷凍保存。

1.4 色譜測定

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱： Eclipse Plus C18RRDH 1.8 μm， 2.1×50 mm， 柱溫： 35 ℃， 流速： 0.2 mL/min， 進(jìn)樣量：2.0 μL， 流動相A： 甲醇（0.1%甲酸， 5 mmol/L 乙酸銨）， 流動相B： 水（0.1%甲酸， 5 mmol/L 乙酸銨）。

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源： 電噴霧離子源， 掃描方式： 正離子掃描， 檢測方式： 多反應(yīng)監(jiān)測（ MRM） ， 電噴霧電壓1 750 V， 輔助氣溫度300 ℃。

定性離子對、 定量離子對、 裂解電壓及碰撞能量見表2。

表2 定性離子對、 定量離子對、 裂解電壓及碰撞能量

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、 回收率和精密度

配制不同質(zhì)量濃度的藜蘆堿標(biāo)準(zhǔn)溶液， 以峰面積為Y 軸， 質(zhì)量濃度為X 軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 線性范圍10～500 ng/mL， 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好（R2＞0.995） 。 分別在空白果蔬中添加0.005， 0.010， 0.050 mg/kg 3 個質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品， 回收率范圍為81.3%～102.5%， 其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 的范圍為2.2%～5.6%， 表明該方法穩(wěn)定可靠[3]。

不同樣品加標(biāo)回收率和精密度見表3。

表3 不同樣品加標(biāo)回收率和精密度

2.2 不同樣品中藜蘆堿殘留的含量

每種蔬菜水果檢測20 個批次。

不同樣品中藜蘆堿殘留的含量見表4。

表4 不同樣品中藜蘆堿殘留的含量/mg·kg-1

由表4 可知， 藜蘆堿在蔬菜水果中的具有一定的檢出率。

3 試驗開發(fā)

3.1 不同提取試劑對試驗回收率的影響

不同提取試劑對試驗回收率的影響見表5。

表5 不同提取試劑對試驗回收率的影響

由表5 可知， 選用乙腈提取為最佳方法。

3.2 不同凈化小柱對回收率的影響

不同凈化小柱試驗的回收率見表6。

由表6 可知， 選用QuECHERS Clean-up Kit 凈化萃取液回收率較高， 實(shí)際操作也較為簡便， 故選用QuECHERS Clean-up Kit 作為凈化方法。

表6 不同凈化小柱試驗的回收率

3.3 不同復(fù)溶溶劑對回收率的影響

不同復(fù)溶溶劑的回收率表7。

由表7 可知， 不同復(fù)溶溶劑的回收率相差不大，相對而言， 已使用甲醇復(fù)溶的回收率較高， 又與儀器進(jìn)樣流動相相同， 所以選用甲醇作為復(fù)溶溶劑。

表7 不同復(fù)溶溶劑的回收率

4 結(jié)論

通過對不同蔬菜水果中藜蘆堿的萃取溶劑、 提取方法、 凈化方法進(jìn)行研究， 確定前處理方法及創(chuàng)建最佳色譜質(zhì)譜條件。 結(jié)果表明， 選用乙腈為萃取試劑， 使用QuECHERS Clean-up Kit 作為凈化方法，選用甲醇作為復(fù)溶溶劑為最佳前處理方法。 以市場購買的樣品檢測結(jié)果得出， 市售的蔬菜水果部分有檢出， 因此有必要對蔬菜水果進(jìn)行藜蘆堿的監(jiān)測，達(dá)到有效監(jiān)管， 更好地維護(hù)消費(fèi)者的健康。