結腸癌患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達及其與預后的關系

王曉燕，肖超，肖佑，潘燎，肖戈

結腸癌是我國常見惡性腫瘤，隨著人們生活水平的不斷提高，結腸癌已躍居城市惡性腫瘤發(fā)病率第2位(33.17/10萬)、死亡率第4位(15.98/10萬)[1]。我國結直腸癌患者早期診斷及治療率偏低，積極推動規(guī)范的結直腸癌早診早治是進一步改善我國結直腸癌患者預后的關鍵[2]。結腸鏡是目前篩查、診斷結直腸癌的主要手段，但結腸鏡屬于有創(chuàng)檢查，不便于在人群體檢中廣泛應用。癌胚抗原和多種糖類抗原等傳統(tǒng)的腫瘤標志物特異度較低，不利于單獨作為結直腸癌的診斷依據[3]。因而，尋找一種早期診斷并能夠提示結腸癌患者預后的生物學標志物顯得尤為重要。微小RNA (microRNA，miRNA) 是近年來關注到的小分子非編碼單鏈RNA，通過與靶基因轉錄的互補位點相結合，抑制靶基因的表達，從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡等過程；此外，miRNA在腫瘤中發(fā)揮重要的生物學功能。近年來發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p、miR-376c-3p在宮頸癌、肝癌、胃癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達異常升高[4-7]，通過促進腫瘤血管新生及腫瘤細胞增殖，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望作為腫瘤早期診斷及預后評估的生物學指標。本研究通過分析結腸癌患者血清中miR-221-3p及miR-376c-3p表達，分析兩者在結腸癌中的臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月—2018年5月湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院肛腸科診治結腸癌患者104例(結腸癌組)和非腫瘤結腸病患者56例(良性疾病組)，以門診行健康查體50例為健康對照組。結腸癌組男68例，女36例，年齡38～76(59.2±7.0)歲。良性疾病組男37例，女19例，年齡41～77(59.5±6.8)歲。健康對照組男35例，女15例，年齡40～78(60.5±6.3)歲。3組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準通過(倫批號：2018-HN-0032)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 結腸癌組病例選擇標準 (1)納入標準：①初次發(fā)現(xiàn)；②結腸癌診斷符合“中國結直腸癌診療規(guī)范”標準[8]；③術前無腫瘤治療史。(2)排除標準：①臨床病理及隨訪資料不完整；②有其他惡性腫瘤史；③合并結直腸的急慢性感染性疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-221-3p、miR-376c-3p基因表達檢測：取各組受試者晨起空腹肘靜脈血約5 ml，靜置30 min，離心取上層血清進行檢測。應用總RNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)檢測血清總RNA水平，以Narodrop1000檢測RNA濃度后，按逆轉錄試劑盒說明書(北京索萊寶公司)進行逆轉錄。將產物cDNA進行熒光定量PCR反應。miR-221-3p、miR-376c-3p及內參U6引物序列見表1。總體系20 μl，包括模板1 μl，引物2 μl，Master Mix 10 μl，ddH2O 7 μl。反應程序：95℃ 3 min、95℃ 20 s、60℃ 15 s，共40個循環(huán)。結果以2-ΔΔCt值法表示。以miR-221-3p、miR-376c-3p表達量的平均數(shù)5.43、6.17為界，分為高表達亞組和低表達亞組。

表1 miR-221-3p、miR-376c-3p基因檢測引物序列

1.3.2 隨訪情況：結腸癌患者自出院后開始隨訪，每個月進行一次電話隨訪，隨訪時間36個月，隨訪截止至2021年5月31日，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結束。隨訪患者生存等情況。

2 結 果

2.1 3組血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達比較 血清miR-221-3p、miR-376c-3p水平比較，結腸癌組>良性疾病組>健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 3組血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達比較

2.2 結腸癌患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達的相關性 Pearson線性相關分析結果顯示，血清miR-221-3p與miR-376c-3p表達呈正相關(r=0.567，P=0.000)。

2.3 血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達在不同臨床/病理特征中比較 結腸癌Duke分期C～D期、腫瘤低分化及有淋巴結轉移患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達均高于Duke分期A～B期、腫瘤高中分化及無淋巴結轉移患者(P均<0.01)，而在患者性別、年齡及腫瘤大小中比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表3。

表3 結腸癌患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達在不同臨床/病理特征中比較

2.4 血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達對結腸癌預后的影響 104例結腸癌患者隨訪3～36(21.1±4.3)月，死亡61例，3年生存率為41.3%(43/104)。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，血清miR-221-3p高表達亞組患者3年總體生存率為21.1%(11/52)，明顯低于低表達亞組的61.5%(32/52),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.134，P=0.000)；血清miR-376c-3p高表達亞組患者3年總體生存率為23.5%(12/51)，低于低表達亞組的58.5%(31/53),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.736，P=0.002)，見圖1。

圖1 不同血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達結腸癌患者生存曲線

2.5 血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達對結腸癌患者預后分析 以結腸癌患者生存預后為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時間)，納入miR-221-3p(賦值1=高表達，0=低表達)、miR-376c-3p(賦值1=高表達，0=低表達)為自變量，COX分析結果顯示，血清miR-221-3p、miR-376c-3p高表達是影響結腸癌預后的危險因素，見表4。

表4 影響結腸癌患者預后的危險因素分析

3 討 論

目前結腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[9]。隨著分子生物學的進步，研發(fā)出新的靶向治療藥物，如酪氨酸激酶抑制劑等，一定程度上可改善結腸癌患者的生存預后[10]。腫瘤分期、腫瘤分化及淋巴轉移均是影響結腸癌預后的危險因素。但結腸癌是一種異質性較高的腫瘤，臨床上發(fā)現(xiàn)，相同腫瘤Duke分期的結腸癌患者對治療的敏感性不一致，部分患者存在治療抵抗，并快速發(fā)生腫瘤進展轉移[11]。深入研究結腸癌的發(fā)病機制，尋找影響腫瘤細胞惡性生物學行為的關鍵基因，對于結腸癌患者的預后判斷及個體化治療選擇，具有重要意義。

miRNAs是長度介于20～25個核苷酸的無蛋白編碼功能的調節(jié)分子，通過參與構成RNA誘導的沉默復合物發(fā)揮調控靶基因表達的功能。以往被認為是細胞內的“轉錄垃圾”，隨著近年來研究的深入，發(fā)現(xiàn)miRNAs不僅參與人類正常的生長發(fā)育、衰老等過程，還在心血管疾病、腫瘤及炎性反應等人類多種疾病中發(fā)揮重要調節(jié)功能[12-15]。近年來研究表明，多種腫瘤中存在大量miRNAs如miR-221-3p、miR-376c-3p等的表達異常，并能夠通過調控下游癌基因或抑癌基因的表達，影響腫瘤的進展[16-18]。miR-221-3p編碼基因位于Xp11.3，研究表明，miR-221-3p在宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤表達上調[4-5，19]，作為促癌基因發(fā)揮腫瘤促進的功能。本研究中，結腸癌患者血清中miR-221-3p過表達。目前結腸癌中尚無研究報道m(xù)iR-221-3p表達上調的機制。但miRNA的活性及功能往往受到上游長鏈非編碼RNA(LncRNA)的調控，因此，推測miR-221-3p的高表達可能與LncRNA的表達異常有關。Chen等[20]報道，LncGAS5能夠作為內源性競爭RNA，作為分子支架結合并抑制miR-221-3p的表達，腫瘤中LncGAS5的表達降低導致miR-221-3p顯著升高，激活下游Wnt信號通路，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-221-3p高表達與結腸癌Duke分期(C～D)、低分化程度及淋巴結轉移有關，提示高表達miR-221-3p促進結腸癌進展。miR-221-3p生物學功能的發(fā)揮主要是通過調控下游基因的表達實現(xiàn)的。如腫瘤細胞高表達miR-221-3p通過外泌體釋放到腫瘤微環(huán)境中，通過抑制血小板反應蛋白-2的表達，促進腫瘤血管新生，導致腫瘤發(fā)生轉移[4]。此外，尚有學者證實[21]，miR-221-3p參與調控多種癌基因表達，腫瘤發(fā)生時miR-221-3p表達水平上調，導致下游靶基因SOCS3下調，從而通過JAK/STAT信號通路促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，促進腫瘤的惡性進展。鑒于miR-221-3p高表達與不良的臨床病理參數(shù)有關，miR-221-3p高表達可能影響患者生存預后。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p高表達的結腸癌患者生存預后較差，多因素COX分析結果進一步證實，血清miR-221-3p高表達是患者不良生存預后的獨立危險因素。因此，結腸癌患者血清miR-221-3p高表達參與腫瘤惡性進展，是判斷結腸癌患者不良預后的標志物。

miR-376c-3p的編碼基因位于14q32.31。以往報道表明，miR-376c-3p在不同的人類惡性腫瘤中發(fā)揮不同的生物學功能，具有腫瘤的特異性，如miR-376c-3p在乳腺癌、口腔鱗癌中表達上調，通過調控RAN2A的表達，促進腫瘤細胞的干性維持，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[7，22]。本研究中，結腸癌患者血清中miR-376c-3p高表達。其表達上調的機制尚不清楚，有學者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中miR-376c-3p的表達受到環(huán)狀RNA PIP5K1A的表達調控，環(huán)狀RNAPIP5K1A能夠與 miR-376c-3p結合，提高miR-376c-3p的穩(wěn)定性，兩者協(xié)同促進下游癌基因鋅指蛋白146的表達，促進腫瘤進展[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p高表達與不良的臨床病理特征包括腫瘤Duke分期(C～D)、低分化程度及淋巴結轉移有關，提示miR-376c-3p表達促進結腸癌的惡性進展。有學者在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，SYF2作為一種G1/S期轉換的抑制性調節(jié)因子，具有抑制細胞增殖的作用，miR-376c-3p通過靶向抑制mRNA剪接因子SYF2的表達，促進腫瘤細胞的進展[6]。此外，miR-376c-3p通過靶向HOXB7促進腫瘤細胞的裂變、增殖、遷移和侵襲，并抑制腫瘤細胞的凋亡，進而導致惡性腫瘤的進展[22]。本研究進一步分析結腸癌中miR-376c-3p表達的臨床預后價值，結果發(fā)現(xiàn)miR-376c-3p高表達的結腸癌患者生存預后較差，并且是結腸癌患者不良生存預后的獨立危險因素，表明miR-376c-3p是一種新的判斷結腸癌預后的腫瘤標志物。臨床上可以根據血清miR-376c-3p表達水平對結腸癌患者的預后進行評估預測，進而選擇個體化的治療方案，以提高臨床治療效果。

腫瘤中存在大量miRNA表達上調或下調，形成復雜的調控網絡，影響疾病進展。本研究中，結腸癌患者血清miR-221-3p與miR-376c-3p表達呈正相關。分析其機制，可能與兩者在結腸癌中發(fā)揮協(xié)同作用有關。Yang等[24]報道，miR-221-3p能夠通過靶向抑制抑癌基因Bcl-2的表達，而促進促癌基因Bad的表達，抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤進展。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p通過LINC00152，能夠促進調控下游Bcl-2的表達，進而抑制腫瘤凋亡的發(fā)生。因此，miR-221-3p和miR-376c-3p在調控腫瘤細胞凋亡過程中可能發(fā)揮協(xié)同作用。但兩者的具體作用機制仍有待深入探索。

綜上所述，結腸癌患者血清中miR-221-3p、miR-376c-3p表達升高，miR-221-3p與miR-376c-3p表達之間呈正相關。血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達與腫瘤分期、分化程度及淋巴轉移有關，是新的結腸癌預后判斷的分子標志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王曉燕：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;肖超：提出研究思路，分析試驗數(shù)據，論文審核;肖佑：資料搜集整理，實施研究過程;潘燎、肖戈：實施研究過程，參與撰寫