響應(yīng)面法優(yōu)化清胃散水提工藝研究*

歐麗娜，鄭曉丹，毛文偉，李云霞，王 珂，張奧攀，李 杰

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471000）

清胃散首載于李東垣《脾胃論》，是由升麻、黃連、當(dāng)歸、生地黃、牡丹皮5味中藥組成，具有清胃涼血之功，主治胃中積熱，牙痛牽引頭痛，面頰發(fā)熱，其齒喜冷惡熱，或牙齦紅腫潰爛，或唇舌腮頰腫痛，口氣熱臭，口干舌燥，舌紅苔黃，脈滑數(shù)[1]。臨床上常用于治療口腔炎、牙髓炎[2]、牙周炎[3]等屬胃火上攻者。傳統(tǒng)用法為“水一盞半，煎至七分，去渣，放冷服之”。該方法攜帶不便且質(zhì)量不可控，但目前并未有成藥上市，亟待開發(fā)合適的劑型，補充臨床所需。

響應(yīng)面法適用于考察連續(xù)變量及非線性數(shù)據(jù)處理等問題。因此，筆者采用多指標(biāo)分析，以方中君藥黃連的主要成分鹽酸小檗堿含量[4]及復(fù)方的出膏率為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計法，對其水提工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，以期為清胃散制成現(xiàn)代劑型提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（LC2000，上海天美科學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平（FA2204B，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗儀（KQ2200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-4A，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司）；真空干燥箱（02R-6030，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 藥物與試劑 黃連、升麻、生地黃、牡丹皮、當(dāng)歸等藥材飲片均購于河南省洛陽市張仲景大藥房股份有限公司。鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201613，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、磷酸、磷酸二氫鉀為色譜純，甲醇、十二烷基硫酸鈉、硅藻土為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法 分別按照處方比例稱取各藥材飲片，粉碎過12目篩，按各試驗設(shè)計量加入適宜體積倍數(shù)的純凈水，浸泡相應(yīng)時間，加熱回流提取相應(yīng)時間及次數(shù)，4層紗布過濾，濾液合并，置恒溫水浴鍋濃縮成稠膏，備用。

2.2 出膏率測定方法 取各試驗組稠膏，置于真空干燥箱105 ℃烘干3 h，移置干燥器中冷卻30 min，迅速精密穩(wěn)定質(zhì)量，以干燥品重量與原藥材重量比計算出膏率。

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 固定相：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（45∶55，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm[5]；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.140 mg/mL的對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.2”項下干膏適量，按照比例1∶1.5稀釋。取稀釋液1 mL與硅藻土2.5 g混勻，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲30 min，取上清液2 mL轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，甲醇鹽酸溶液（100∶1）定容得到供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

位于瑞金西北隅岡面鄉(xiāng)竹園村的中央蘇區(qū)紅軍兵工廠，是在第五次反“圍剿”戰(zhàn)爭初期，陸續(xù)從興國、于都等地遷入的官田兵工廠、寨上雜械廠和銀坑彈藥廠等軍工企業(yè)合并而成的。全廠六七百人的職工隊伍中，就有來自江西、福建、廣東、上海、沈陽各地的人。他們有的是自愿當(dāng)紅軍來的，有的是被俘的國民黨軍人愿意留下來的，有的是經(jīng)當(dāng)?shù)攸h組織動員或派遣來的。因而由鄉(xiāng)土意識、生活習(xí)慣、思想覺悟等差異而產(chǎn)生的不團結(jié)現(xiàn)象時有發(fā)生，有時還因此影響了廠里的生產(chǎn)。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備 按處方比例稱取除黃連外其他處方藥材，8倍水，浸泡1 h，回流2 h進(jìn)行提取一次進(jìn)行試驗。煎液濾過、濃縮及定容處理方法同“2.3.3”，制備陰性對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.5 測定法 精密吸取“2.3.2”或“2.3.3”或“2.3.4”項下制得的對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測定，即得。（見圖1）

圖1 鹽酸小檗堿對照品、供試品及陰性對照品HPLC 色譜圖

2.3.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.2”項下制備的對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，制成質(zhì)量濃度分別為2.8 μg/mL、5.6 μg/mL、8.4 μg/mL、11.2 μg/mL、14.0 μg/mL的系列對照品溶液，依照“2.3.1”項的色譜條件進(jìn)行檢測。依次記錄峰面積，以鹽酸小檗堿對照品峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=248 894x+115 651（R2=0.999 6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對照品質(zhì)量濃度在2.8～14.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4 單因素考察 分別對清胃散水提工藝中原料藥材粉碎與否、浸泡時間、提取時間、加水量及提取次數(shù)進(jìn)行了單因素考察，根據(jù)考察結(jié)果，確定Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法中因素水平范圍。

2.4.1 粉碎度初步考察 按照處方比例，平行稱取原料藥2份，分別以粉碎過12目篩和不粉碎進(jìn)行試驗，8倍量水浸泡1 h，回流2 h，提取1次，濾過，濾液濃縮，干燥，依法進(jìn)行鹽酸小檗堿含量測定。結(jié)果顯示，粉碎組鹽酸小檗堿含量明顯高于未粉碎組，故選擇原料藥粉碎過12目篩。

2.4.2 浸泡時間初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥4份，粉碎，過12目篩，分別浸泡0.5、1、1.5、2 h，加8倍量水，回流提取2 h，提取次數(shù)為1次，依法測定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果顯示，浸泡1.5 h后鹽酸小檗堿含量增長不明顯，故響應(yīng)面設(shè)計法浸泡時間的水平選取1、1.5和2 h。

2.4.3 提取時間初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥4份，粉碎，過12目篩，加8倍量水，浸泡1.5 h，提取1次，分別考察回流時間為0.5、1、1.5、2 h對提取效率的影響。結(jié)果顯示，提取時間在1.5 h時鹽酸小檗堿含量有較大的提升，隨后變化不顯著，故響應(yīng)面設(shè)計法提取時間的水平選取0.5、1、1.5 h。

2.4.4 加水量初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥4份，粉碎，過12目篩，分別加入6倍、8倍、10倍和12倍量水，浸泡1.5 h，回流提取2 h，提取1次，依法測定并計算綜合評分，結(jié)果顯示，加水量為8倍時，鹽酸小檗堿含量有顯著提升，隨后呈緩慢上升趨勢，故響應(yīng)面設(shè)計法加水量的水平選取8倍、11倍和14倍。

2.4.5 提取次數(shù)初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥3份，粉碎，過12目篩，加入8倍量水，浸泡1.5 h，回流提取1 h，分別提取1次、2次、3次，依法測定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果顯示，提取2次和3次的鹽酸小檗堿含量差別不大，考慮到實際操作時間成本的問題，在進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)選時選取提取2次。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化提取工藝

2.5.1 實驗方案設(shè)計 基于單因素試驗的結(jié)果，對浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮回流時間（C）3個影響因素進(jìn)行三因素三水平實驗設(shè)計，評價指標(biāo)為：采用Hassan公式將鹽酸小檗堿和出膏率進(jìn)行歸一化處理，得到兩個指標(biāo)的幾何均數(shù)OD值。公式如下：OD=（d1×d2×…dn）/n，n為指標(biāo)數(shù)，di=（yi-ymin）/（ymax-ymin），yi為實際值，ymax和ymin為同一指標(biāo)在實驗中的的最大值和最小值[6]。因素水平表和設(shè)計結(jié)果見表1～2。

表1 試驗設(shè)計因素水平表

表2 Box-Behnken 實驗設(shè)計及結(jié)果

2.5.2 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析 采用Hassan公式將鹽酸小檗堿和出膏率2個指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，得到綜合評分的OD值。使用Design-Expert 8.0.6對浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮回流時間（C）進(jìn)行二次多項式回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：OD=0.77+0.11A+0.22B+0.20C-0.099AB-0.025AC-0.003BC-0.11A2-0.15A2-0.23C2。（見表3）

表3 方差分析及顯著性實驗結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知，回歸方程決定系數(shù)R2＝0.95，說明模型擬合情況較好，模型F檢驗P＜0.05，失擬項P＞0.05，表明該回歸模型合理，可以分析和預(yù)測本水提工藝。由表3可知，回歸方程中一次浸泡時間（A）、加水量（B）、提取時間（C）均對綜合評分有顯著影響，二次項加水量（B）和提取時間（C）對綜合評分有顯著影響。各因素的影響程度為B＞C＞A。

采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制浸泡時間、加水量、提取時間的綜合評分的三維響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖2～4所示。預(yù)測最佳水提工藝為：浸泡1.6 h，加水量為11.6倍，提取時間為1.1 h。

圖2 浸泡時間和加水量對OD 值的等高線及響應(yīng)面圖

2.5.3 驗證實驗 根據(jù)最佳提取工藝，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，考慮到實際生產(chǎn)工藝操作常取整數(shù)，故調(diào)整最佳水提工藝為：原料藥材粉碎過12目篩，加11倍量水，浸泡1.5 h，提取2次，回流時間為1 h。按照此工藝進(jìn)行3次平行驗證實驗，OD值分別為0.833、0.829、0.841，平均值為0.834（RSD＝0.843%），與預(yù)測值（0.851）一致，說明該水提工藝優(yōu)化后合理可行。

3 討 論

響應(yīng)面法近年來常被運用于中藥有效成分的提取工藝研究[7-8]，具有實驗次數(shù)少，所得結(jié)果直觀，能夠動態(tài)反應(yīng)指標(biāo)變化的優(yōu)點，本試驗依據(jù)清胃散傳統(tǒng)用法，以水為溶媒，回流提取，采用響應(yīng)面法設(shè)計實驗，HPLC法檢測其中君藥黃連中鹽酸小檗堿的含量，實驗中嘗試了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液的不同配比，并比較了265 nm及345 nm兩種檢測波長[5,9]，根據(jù)色譜峰峰形及供試品雜峰的影響，最終選擇乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液45∶55為流動相，檢測波長為265nm。

清胃散為中藥傳統(tǒng)名方，方中黃連苦寒瀉火，直折胃腑之熱，為君藥；升麻取其清熱解毒，以治胃火牙痛，又可取其輕清升散透發(fā)，可宣達(dá)郁遏之伏火。加上牡丹皮、生地黃涼血滋陰，共同輔助黃連發(fā)揮清胃瀉火之功，共為臣藥；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，以助消腫止痛，為佐藥，升麻兼以引經(jīng)，兼為使藥。研究表明，該方中君藥黃連主要含有生物堿類化學(xué)成分，其中小檗堿含量高達(dá)10%[10]，具有廣譜抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌，以及紅色毛蘚菌、白色念珠菌等真菌敏感[11-12]，同時還有明確的抗炎和抗氧化作用[13-15]；而復(fù)方的出膏率變化對有效成分含量以及制劑的成型等都有顯著影響。故采用Hassan法對其進(jìn)行歸一化處理，得到幾何平均OD值[6]作為評價指標(biāo)，得出的最佳水提工藝為：原料藥材粉碎過12目篩，加11倍量水，浸泡1.5 h，提取2次，回流時間為1 h。

圖3 浸泡時間和提取時間對OD 值的等高線及響應(yīng)面圖

圖4 加水量和提取時間對OD 值的等高線及響應(yīng)面圖