刺莧提取物體外抑石作用研究*

江鳳玉，張一靜，唐靈芝，柯俊芳，陳蘭妹

（廈門醫學院，福建 廈門 361023）

刺莧（Amaranthus spinosus L.）為莧科莧屬一年生草本植物，全草入藥，性甘、涼，有清熱祛濕、散血消炎等療效[1]。因其能夠促進膀胱的濕熱之氣向外排出，能夠消石通淋，刺莧用于治療腎結石，有較好的排石療效，且具有治療周期短、效價高、毒副作用低等優點。刺莧的化學成分和相關活性研究文獻報道較少，目前相關文獻報道的活性主要集中在利尿、免疫、降溫[2]、傷口創面愈合、抗菌[3]、抗炎鎮痛[4]、抗氧化[5-6]等方面。

腎結石的主要組成成分草酸鈣（CaOX）存在兩種形式：一水草酸鈣（COM）和二水草酸鈣（COD），其中COM是COD的兩倍[7]。張生等[8]研究證明COD外表較圓鈍，黏附性不好，易于排出體外；而COM外表較尖銳，易黏附在損傷細胞表面形成結晶。筆者通過體外模擬實驗，利用電子顯微鏡（EM）、傅里葉紅外光譜（FTIR）、掃描電鏡（SEM）、X射線衍射（XRD）等檢測方法，觀察刺莧提取物在體外是否具有抑制COM的生長聚集或促使COM向COD轉化的作用，評估刺莧提取物的排石活性。

1 材料與儀器

1.1 藥材 刺莧，采自福建省漳平市和平鎮野外，經廈門醫學院藥學系中藥專業鮑紅娟副教授鑒定為Amaranthus spinosus L.。

1.2 儀器 Alpha1-2冷凍干燥機（德國christ）；SQP十萬分之一天平（Sartorius）；ALPHA傅里葉紅外光譜儀（德國Bruker）；FlexSEM 1000掃描電子顯微鏡（日本高新技術公司）；XRD6100 X射線衍射儀（日本高新技術公司）。

1.3 試劑 草酸鈉（泰坦科學股份有限公司，批號：P1571587）；無水氯化鈣（批號：2004172）、氯化鈉（批號：20170313）、無水乙酸鈉（批號：20170303）、氫氧化鈉（批號：20200826）、石油醚（60-90）（批號：2102011）、乙酸乙酯（批號：1810091）、正丁醇（批號：1809111）、95%乙醇（批號：2002171）、鹽酸（批號：20071128）均購自西隴科學股份有限公司，分析純。

2 方 法

2.1 刺莧粗提

2.1.1 刺莧全草粗提 取刺莧全草525 g，加入5倍量的65%乙醇浸漬2 h，超聲功率400 W，溫度40 ℃，提取2次，每次1 h。過濾，濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行梯度萃取，濃縮得浸膏后冷凍干燥，得到4個樣品組分，分別為石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層，置于干燥器中貯存。

2.1.2 刺莧根粗提 取刺莧根750 g，加入6.5倍量65%乙醇浸漬2 h，超聲功率400 W，溫度40 ℃，提取2次，每次1 h。過濾，合并濾液濃縮后取少量濃縮液作為醇提層，其余濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行梯度萃取，濃縮得浸膏后冷凍干燥，得到4個樣品組分，分別為醇提層、石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層，置于干燥器中貯存。

2.2 溶液配制與樣品制備

2.2.1 儲備液的配制 溶液A的配制：精密稱取無水氯化鈣、氯化鈉、無水乙酸鈉，先用純化水溶解，后轉移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，搖勻。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH值至5.7，配成濃度為10.0、8.5、1.0 mmol/L的CaCl2溶液。

溶液B的配制：精密稱取草酸鈉、氯化鈉、無水乙酸鈉，先用純化水溶解，后轉移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，搖勻。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH值至5.7，配成濃度為5.0、1.5、1.0 mmol/L的Na2C2O4溶液。

2.2.2 刺莧提取液的制備 稱取刺莧全草和根8個樣品冷凍干燥組分各0.04 g，量取40.0 mL純化水，制備成1 000 μg/mL提取液，過濾，用純化水稀釋配制成750、500、250、125 μg/mL的提取液，備用。

2.2.3 草酸鈣對照品的配制 按鄧芳等[9]的方法，量取1.1 mol/L的氯化鈣溶液、0.2 mol/L的氯化鈉溶液和適量的純化水于干凈的燒杯中，攪拌均勻后加0.033 mol/L的草酸鈉溶液，使最終溶液中c（Ca2+）=c（C2O42-）=11.0 mmol/L，攪拌反應20 min，密封，陳化12 h。

將陳化好的草酸鈣溶液用0.22 μm微孔過濾膜過濾，得草酸鈣沉淀，真空干燥，40 ℃，過夜，得空白對照品。

2.2.4 草酸鈣樣品的配制 取干凈燒杯，分別加入1.1 mol/L的氯化鈣溶液，濃度為1 000、750、500、250、125 μg/mL的刺莧根提取物及適量的純化水，參考草酸鈣對照品的配制，得草酸鈣樣品。

2.3 刺莧提取物體外抑石作用研究 將制備得到的草酸鈣對照品和草酸鈣樣品進行EM、SEM、FTIR、XRD分析，通過FTIR檢測COD紅外特征峰（νs 1 324 cm-1和νas 1 646 cm-1）進行定性分析，XRD檢測COD晶面（200）進行定量分析。

2.3.1 電子顯微鏡法觀察 24孔板中加入475 μL溶液A，50 μL的1 000 μg/mL刺莧全草水層提取液，475 μL的溶液B，制成不同摩爾比的草酸鈣溶液[10]。以含有50 μL純化水的樣品代替刺莧提取物作為空白對照。置于不同倍數的顯微鏡下觀察，并對晶體大小、形狀和密度進行定性分析。

2.3.2 SEM觀察草酸鈣晶體的外部形態結構 參考文獻[11]，制備草酸鈣晶體，量取0.01 mol/L的氯化鈣溶液、0.2 mol/L的氯化鈉溶液及適量的純化水，待攪拌均勻后，加0.01 mol/L的草酸鈉溶液，使c（Ca2+）=c（C2O42-）=1.00 mmol/L，攪拌反應20 min，超聲功率100 W，溫度30 ℃，15 min，得樣品溶液。

在培養皿中放大小相當的圓形濾紙，用鑷子夾取5 mm×5 mm的單晶硅片，光亮面朝上，放于濾紙中央，用1～2滴無水乙醇清洗硅片，待干后加入上述溶液50 μL，自然晾干，得草酸鈣樣品。進行SEM觀察，電壓10 kV。

2.3.3 XRD的測試條件 參照胡鵬等[12]的XRD測試條件：Cu靶，Kα輻射，40 kV，20 mA；狹縫：DS，1°，RS，0.15 mm，SS，1；掃描速度：8（°）/min，掃描范圍：2θ為5°～60°。

2.3.4 COD百分含量計算 按照文獻[13]的實驗方法，用COD(%)=ICOD/（ICOM+ICOD)×100%計算樣品中COD的百分含量，式中ICOM為COM（101）晶面的強度，ICOD為COD（200）晶面的強度。

3 結果與討論

3.1 EM結果分析 空白對照品中，隨著溶液中Ca/Ox摩爾比的減少，生成的草酸鈣晶體數量增加，且晶形也不同。（見圖1～8）劉虹等[14]的研究也表明，草酸鹽濃度對草酸鈣的形成影響更大。在空白對照品中分別加入1 000 μg/mL刺莧全草水層提取物后，可以發現所形成的草酸鈣晶體相應的數量增加，但晶形聚集變小，聚集形狀由尖銳變為較圓鈍。由此可見，刺莧全草水層提取物具有一定的抑制草酸鈣晶體生長和聚集的作用。由ZARIN M A等[15]的研究結果可推測刺莧全草水層提取物中可能含有皂苷、黃酮苷等成分。

圖1 空白對照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

圖2 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM圖

圖3 空白對照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM 圖

圖4 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+):c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM圖

圖5 空白對照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

圖6 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=10∶1]EM圖

圖7 空白對照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

圖8 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=1∶5]EM圖

3.2 草酸鈣對照品結果分析

3.2.1 SEM結果分析 由文獻[8]可知，草酸鈣晶體的SEM圖像，COM多為外表棱角分明的六角形狀，COD為較圓鈍的四邊形椎體。本實驗制備的草酸鈣晶體對照品中大多為COM。（見圖9）

圖9 草酸鈣晶體對照品的SEM 圖

3.2.2 FTIR結果分析 在COM和COD的標準紅外光譜圖中，在3 000～3 600 cm-1處的寬峰由O-H的伸縮振動引起，其中COM分裂成5個小峰，而COD為1個大峰，強度比COM強，主要是因為COD比COM多含有1個H2O。草酸根（COO-）的對稱伸縮振動νs（COO-）分別為1 316 cm-1和1 324 cm-1，反對稱伸縮振動νas（COO-）分別為1 620 cm-1和1 646 cm-1。指紋區COM的吸收帶出現在949 cm-1、885 cm-1和663 cm-1，COD則出現在912 cm-1和611 cm-1處[17]。（見圖10）

圖10 一水草酸鈣（上）和二水草酸鈣（下）的標準IR 譜圖[16]

經FTIR定性，草酸鈣對照品草酸根（COO-）的對稱伸縮振動νs（COO-）與COD的對稱伸縮振動峰相似，而反對稱伸縮振動νas（COO-）主要存在COM的反對稱伸縮振動峰，指紋區出現COM的吸收峰663 cm-1，說明草酸鈣對照品中同時存在COM和COD，以COM為主。（見圖11）

圖11 草酸鈣對照品IR 圖

3.2.3 XRD結果分析 由文獻[7]可知，COM主要晶面為（101）、（020）、（202）、（130），COD主要晶面為（200）、（211）、（400）、（213）。草酸鈣對照品的XRD圖中以COM晶面為主要存在形式。（見圖12）

圖12 草酸鈣對照品XRD 圖

因此，綜上可以確定草酸鈣對照品中的主要成分主要為COM。本實驗擬通過FTIR和XRD，將草酸鈣樣品與草酸鈣對照品進行比較，觀察刺莧根提取物是否可以抑制草酸鈣晶體中COM的生長或誘導COD的形成，探究其是否存在抑石作用。

3.3 草酸鈣樣品結果分析

3.3.1 FTIR結果分析 FTIR測定結果發現，4個刺莧根提取物的5個不同濃度FTIR結果相差不大，結合XRD結果，分別從中選取一個作用較明顯的濃度進行比較。（見圖13～16）

圖13 醇提層樣品500 μg/mL IR 圖

圖14 正丁醇層樣品500 μg/mL IR 圖

圖15 乙酸乙酯層樣品1 000 μg/mL IR 圖

圖16 石油醚層樣品1 000 μg/mL IR 圖

將草酸鈣對照品與草酸鈣樣品的FT-IR譜圖進行對比，結果見表1。

表1 不同草酸鈣樣品的FT-IR 檢測結果

由表1可知，刺莧根4個不同部位提取物制備的草酸鈣樣品的對稱伸縮振動νs（COO-）無明顯差異，與COD的對稱伸縮振動峰相似。而反對稱伸縮振動νas（COO-），正丁醇層和石油醚層顯示COD伸縮振動峰，醇提層和乙酸乙酯層無顯著區別，主要與COM的伸縮振動峰相似。

由FTIR譜圖結果可知，刺莧根的4個不同部位提取物制備得到的草酸鈣樣品，均存在COD的特征峰，說明刺莧根提取物可以誘導COD的生成，具有一定的抑石活性。

3.3.2 XRD結果分析 根據COD（%）=ICOD/（ICOM+ICOD）×100%計算COD的百分含量，結果見表2。

表2 不同草酸鈣樣品所含COD 的含量

由表2可知，刺莧根的4個不同部位提取物制備的草酸鈣樣品中含有一定量的COD，且隨著濃度的增加，誘導生成的COD百分含量增加。由XRD圖可以看出，草酸鈣樣品中均以COM晶面為主要存在形式，COD晶面僅少量存在。（見圖17～18）由此可見，刺莧根的4個不同部位提取物均有一定程度的誘導COD晶體形成的作用，但作用并不顯著。

圖17 醇提層500 μg/mL XRD 圖

圖18 石油醚層1 000 μg/mL XRD 圖

4 結 論

腎結石是泌尿系統的常見病，草酸鈣結石在腎結石中最常見[18]，本實驗采用EM、FTIR、XRD、SEM等方法比較研究了刺莧根4個不同部位提取物對草酸鈣晶體生長的調控作用。研究表明，4個不同部位的刺莧根提取物有一定的抑制草酸鈣晶體成核和生長，以及誘導COD晶體形成的作用，但作用不顯著。結合本課題組的前期研究[19]，在以小鼠為實驗對象建立的體內草酸鈣結石損傷模型中，刺莧根正丁醇層提取物表現出明顯的排石活性，可以發現刺莧提取液的排石活性機制可能主要為利尿作用，抑石作用較為微弱。