紅柄白鵑梅葉醇提物對糖尿病小鼠胰腺氧化應激的影響

彭華強，蔡金玲，梁文彬

（梧州市中醫醫院，廣西 梧州 543000）

隨著社會和經濟的發展，全球的生活模式及飲食習慣已逐漸改變。我國的飲食習慣和生活方式已向高脂高糖飲食和輕型體力勞動模式轉變，而這種轉變使糖尿病患者數量急劇增加。目前，全球糖尿病患者已達到4.22億，我國則是糖尿病患者最多的國家，且發病率逐年增長，并有年輕化的趨勢[1-2]。糖尿病是一種胰島素分泌功能障礙的代謝性疾病，目前對糖尿病的治療手段以調控血糖為主，但無法進行根治，這也意味著糖尿病患者需終身接受治療[3]。對普通家庭來說，糖尿病的治療嚴重增加了家庭的負擔，且影響患者的生存質量。故積極探索治療糖尿病的藥物，對于糖尿病的防治具有重要意義。紅柄白鵑梅葉為薔薇科白鵑梅屬落葉灌木紅柄白鵑梅（Exochorda giraldii Hesse）的干燥葉子，性味甘平，歸肝、腎經，其根皮、樹皮、葉子通常作為入藥部位，具有通絡止痛、清熱解毒的功效，同時具有清除氧自由基的作用[4]。本課題組前期的預實驗發現紅柄白鵑梅葉醇提物具有調控糖尿病小鼠血糖的作用，但其降糖機制有待探究。故本研究以糖尿病小鼠為模型，探討紅柄白鵑梅葉醇提物對糖尿病小鼠胰腺氧化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡SPF級雄性昆明種小鼠60只，體質量18～22 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（桂）2019-0005。小鼠飼養于通風良好的環境，室溫保持于18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h光照晝夜循環。本研究嚴格按動物倫理要求進行實驗。

1.2 藥物與試劑 紅柄白鵑梅葉購自玉林藥材市場，由廣西醫科大學藥學院朱丹教授鑒定為紅柄白鵑梅（Exochorda giraldii Hesse）的干燥葉子。紅柄白鵑梅葉醇提物由本實驗室采用70%乙醇溶液，料液比為1 g∶30 mL，在50 ℃溫度下回流提取2 h，過濾，收集濾液。重復提取3次，合并濾液，用HPDBJQH型大孔樹脂，以70%乙醇洗脫后所得。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥，批號：AAL7603）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號：SLBB8324V）；ROS試劑盒（上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號：20191015）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191112）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191114）；氧化氫酶（CAT）試劑盒（上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號：20191107）；小鼠空腹胰島素（FINS）ELISA試劑盒（江萊生物，批號：JL19252）。

1.3 主要儀器 DDL-5型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；羅氏卓越型血糖儀（ACCU-CHEK Performa）；MPI-B型化學反應發光多功能檢測器（西安瑞邁公司）；9602A-酶標儀（北京艾普生物設備有限公司）。

1.4 造模及分組 隨機取50只昆明種雄性小鼠，實驗前禁食不禁水12 h，尾靜脈注射用4 ℃的枸櫞酸緩沖液（pH=7.4）所溶解的STZ（50 mg/kg），1次/d，連續注射3 d，注射后予高脂高糖飼料喂養42 d。末次注射后42 d血糖儀檢測小鼠空腹血糖（FBG），以FBG≥11.1 mmol/L的小鼠為糖尿病模型[4-5]。將造模成功的48只糖尿病模型小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組、紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組，每組10只；2只造模失敗小鼠及未能隨機入組的8只糖尿病小鼠排除入組。另取10只健康昆明種雄性小鼠作為正常對照組。

1.5 實驗給藥 二甲雙胍組小鼠灌胃給予二甲雙胍生理鹽水混懸液，32 mg/kg；紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠分別灌胃予高、低劑量紅柄白鵑梅葉醇提物生理鹽水混懸液，劑量分別為150、75 mg/kg；正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續灌胃4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 血糖、血清胰島素含量測定[6]末次給藥2 h后，取小鼠尾部末梢血，血糖儀檢測血糖。摘眼球取血，離心分離血清，酶聯免疫法（ELISA）檢測血清中胰島素（FINS）含量，按公式計算胰島素敏感指數（ISI）和胰島素抵抗指數（IRI）。ISI＝ln（1/FBG×FINS）；IRI＝FBG×FINS/22.5。

1.6.2 胰腺組織病理學觀察 取血后，頸椎脫臼處死小鼠，鈍性分離胰腺，切取部分胰腺組織置于10%甲醛固定液中，制蠟塊，病理切片，HE染色，觀察胰腺病理學變化。

1.6.3 胰腺組織中氧化應激因子含量測定 切取部分胰腺組織，充分碾磨并經RIPA裂解液裂解后，3 500 r/min、4 ℃的高速低溫條件下離心10 min，吸取上清液。ELISA試劑盒檢測胰腺組織中氧化應激因子谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

1.6.4 胰腺組織中活性氧（ROS）含量測定 采用魯米諾化學發光法測定胰腺組織中ROS水平。切取部分胰腺組織，制備成10%的組織勻漿，稀釋于pH值為7.4的Krebs-Hepes緩沖液中。加辣根過氧化物酶對其進行催化反應。使用MPI-B型多參數化學發光檢測儀對催化反應溶液進行發光檢測，溶液發光后加入0.1 mL魯米諾（5 mmol/L）。Origin軟件統計發光峰面積，計算發光強度表示ROS水平的高低。

1.7 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，計量資料以“均數±標準差”（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進一步采用Bonferroni法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-WallisH秩和檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠給藥前后FBG比較 給藥前，模型組、二甲雙胍組、紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組、紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠FBG均明顯高于正常對照組（P＜0.05），證明造模成功。給藥后，與正常對照組比較，模型組小鼠FBG明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FBG均明顯降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FBG均升高（P＜0.05），且紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠FBG高于紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠給藥前后FBG 比較（，mmol/L）

表1 各組小鼠給藥前后FBG 比較（，mmol/L）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組小鼠胰腺組織病理學改變情況 正常對照組小鼠胰腺組織細胞完整、胰島數量豐富，大小均勻；模型組小鼠胰島排列紊亂且分布較散，其大小不一，皺縮變形，有大量空泡出現及炎癥細胞浸潤；二甲雙胍組小鼠胰島形狀有所恢復，數量較模型組多，存在少量空泡及炎癥細胞浸潤；紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰島細胞皺縮得到明顯改善，空泡數量少于模型組；紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠胰島細胞形狀較紊亂，有明顯皺縮現象，存在較多的空泡和炎癥細胞浸潤。（見圖1）

圖1 各組小鼠胰腺的病理學改變情況（HE，×400）

2.3 各組小鼠FINS、ISI、IRI比較 與正常對照組比較，模型組小鼠FINS和ISI均降低，IRI升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FINS和ISI均升高，IRI均降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FINS和紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠IRI均降低（P＜0.05），而紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠ISI與二甲雙胍組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠FINS、ISI、IRI均低于紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠FINS、ISI、IRI 比較（）

表2 各組小鼠FINS、ISI、IRI 比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組小鼠胰腺中氧化應激因子活性比較 與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺中SOD、CAT、GSH-Px的活性均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠胰腺中SOD、CAT、GSH-Px的活性均升高（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠胰腺中SOD、CAT、GSH-Px的活性和紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中SOD、CAT的活性均降低（P＜0.05），而紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中GSH-Px的活性與二甲雙胍組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中SOD、GSH-Px的活性高于紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組（P＜0.05），而CAT的活性與紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠胰腺中氧化應激因子活性比較（，U/mg）

表3 各組小鼠胰腺中氧化應激因子活性比較（，U/mg）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組小鼠胰腺中ROS含量比較 與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺中ROS含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠胰腺中ROS含量均明顯降低（P＜0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠胰腺中ROS含量高于二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組（P＜0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中ROS含量與二甲雙胍組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠胰腺中ROS 含量比較（，nmol/mg）

表4 各組小鼠胰腺中ROS 含量比較（，nmol/mg）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

3 討 論

糖尿病的發病、發展及其并發癥的出現與氧化應激的損傷作用有著密切的關系。持續的高糖內環境，可激活糖自氧化、多元醇代謝等反應及蛋白激酶C的活性增加，降低自身抗氧化能力，促使ROS的產生，造成機體氧化應激，氧化損傷多種蛋白分子，破壞細胞的正常功能和完整性，影響糖尿病及其并發癥的發生[7-8]。糖尿病發病初期，持續的高血糖會使25%～50%的胰島β細胞受損，隨著病程的發展，β細胞受損數量會持續增加，甚至會完全喪失生理功能[9]。因此，緩解機體氧化應激狀態，保護胰島β細胞功能是預防或治療糖尿病的關鍵。

糖尿病發病的基礎是機體外周組織如肌肉和脂肪的胰島素抵抗和其β細胞胰島素分泌缺陷。而胰島素抵抗程度、胰腺損傷和β細胞數量減少與ROS的異常有著密切的關系。正常情況下，胰島素和胰島素受體結合后會將信號向下游傳遞，正常作用于骨骼肌、肝臟和脂肪。而在ROS異常大量形成的情況下，會阻礙胰島素受體底物1的磷酸化進程，降低胰島素受體底物1與胰島素受體的結合能力，影響胰島素信號傳導而引起IR的發生[10-12]。同時機體在氧化還原狀態失衡時，ROS會影響葡萄糖轉運體的正常轉錄，導致胰島素抵抗發生[13]。本研究結果顯示，紅柄白鵑梅葉醇提物能降低糖尿病小鼠FBG和IRI，升高FINS、ISI，提示紅柄白鵑梅葉醇提物有調節糖尿病模型小鼠血糖代謝紊亂的作用。

糖尿病病理狀態下，胰島β細胞中的GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶活性低下，未能有效清除因高糖而產生的過量ROS和脂質過氧化產物，造成大量ROS及脂質過氧化產物在胰腺組織中的堆積，形成氧化應激反應，破壞胰腺組織線粒體內外膜的結構，影響線粒體能量代謝，進而抑制β細胞胰島素的合成和分泌[14-15]。本研究結果顯示，紅柄白鵑梅葉醇提物能增加胰腺組織中CAT、SOD、GSH-Px的活性，減少胰腺組織中ROS的含量，提示紅柄白鵑梅葉醇提物可減少胰腺中ROS的含量，改善機體氧化應激水平。

綜上所述，紅柄白鵑梅葉醇提物具有調節血糖、改善胰島素抵抗的作用，其作用機理可能與其提高機體中抗氧化因子的活性，減少ROS的含量，以及調節機體氧化應激水平有關。