知黃潰瘍合劑對復發性口腔黏膜潰瘍大鼠創面修復的作用及對MCP-1/CCR2/NF-κB通路的影響*

耿乾書，姚 娜，王 雯，李慶隆

（唐山市協和醫院，河北 唐山 063000）

復發性口腔黏膜潰瘍為口腔科最常見的口腔黏膜疾病，發生率位居口腔黏膜病首位，主要表現為口腔黏膜反復出現孤立橢圓形或者圓形淺表潰瘍，可單發或多發于口腔黏膜任意位置，有復發性、周期性特征[1-2]。當前，西醫對復發性口腔黏膜潰瘍的治療方法雖多，但無特效療法[3]。中醫對復發性口腔黏膜潰瘍早有認知，認為外感六淫燥火、內傷臟腑熱盛為其主要致病因素，提出了諸多治療方劑，其中知黃潰瘍合劑療效顯著[4]，但其對復發性口腔黏膜潰瘍創面的修復機制尚不清楚。故本研究制備了復發性口腔黏膜潰瘍大鼠模型，研究知黃潰瘍合劑的具體作用及機制，以期為臨床應用提供理論基礎與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SPF級雄性健康SD大鼠70只，體質量260～280 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。分籠飼養，自由攝食、飲水，室溫24～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替照明，實驗開展前適應性飼養1周。本研究已經醫學實驗動物管理委員會批準，批準號：20200115。

1.2 藥物與試劑 弗氏完全佐劑（上海雷浩信息科技有限公司，貨號：F5881）；左旋咪唑水溶液（山東博山制藥有限公司，批號：170325）；知黃潰瘍合劑（四川省南充市中心醫院，批號：170323）；大鼠γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號：20190411）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA試劑盒（批號：20190406）均購自上海江萊生物科技有限公司；大鼠T淋巴細胞亞群試劑盒（北京科瑞美科技有限公司，批號：20190412）；APC-CD3抗體（批號：20190621）、PE-CD4抗體（批號：20910814）、FITC-CD8抗體（批號：20190119）均購自上海研生實業有限公司；10%溶血素（美國Beckman Coulter公司，批號：20180115）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（中國碧云天生物技術有限公司，批號：20190519）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（批號：20190811）、細胞裂解液（批號：20181214）均購自中國碧云天生物公司；兔抗大鼠β-actin（批號：20190517）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）（批號：20190305）、趨化因子受體-2（2CC-Chemokine Receptor 2，CCR2）（批號：20190905）、核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）（批號：20190817）、磷酸化型NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體（一抗）（批號：20190929）均購自西寶生物科技股份有限公司；辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記山羊抗兔IgG二抗（北京百奧萊博科技有限公司，批號：20190425）。

1.3 主要儀器 FSH-2可調高速勻漿機（常州市金壇區環宇科學儀器廠）；5415D型離心機（廣州和竺生物科技有限公司）；Leica RM2235超薄石蠟切片機（德國徠卡微系統有限公司）；EPICS-reg ALTRA型流式細胞儀（山東博科干細胞應用研究院有限公司）。

1.4 造模與分組 70只大鼠隨機選取15只用于制作復發性口腔黏膜潰瘍抗原，具體操作：脫頸處死大鼠，無菌操作剝離大鼠口腔黏膜，生理鹽水沖洗，加入10倍量的生理鹽水，采用高速勻漿機2 000 r/min勻漿20 min，制好的黏膜勻漿置于-20 ℃保存。將等量的弗氏完全佐劑和黏膜勻漿混勻，期間順時針方向逐滴加入研磨，研磨至乳劑。其余55只大鼠隨機選取10只作為對照組，剩余45只采用免疫法制備復發性口腔黏膜潰瘍大鼠模型[5]，常規消毒45只造模大鼠脊柱兩側，皮內注射上述乳劑，每只注射2點，每點0.1 mL，每周注射1次，連續注射8周。大鼠口腔黏膜多處腫脹，下齒齦有充血、紅腫、潰瘍創面，即為造模成功。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組，每組10只。

1.5 實驗給藥 造模成功24 h后開始給藥，大鼠的等效劑量為成人劑量6.3倍，故左旋咪唑組大鼠予以2 mL左旋咪唑水溶液灌胃，20 mg/kg；知黃潰瘍合劑低、高劑量組大鼠分別予以2 mL知黃潰瘍合劑灌胃，原生藥劑量分別為4、8 g/kg；模型組、對照組大鼠予等體積生理鹽水灌胃。1次/d，連續給藥20 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠口腔潰瘍變化 觀察各組大鼠造模后口腔潰瘍數目、干預后潰瘍愈合程度，其中口腔黏膜潰瘍組織學分級標準見表1，計算各組大鼠口腔潰瘍數目平均值、潰瘍愈合評分平均值。

1.6.2 大鼠血清炎癥因子 末次干預后，大鼠禁食不禁水16 h，2%戊巴比妥鈉麻醉后，脫頸處死，在腹主動脈取血5 mL置入試管內，室溫下靜置30 min，離心機3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，分離血清。按ELISA試劑盒說明書檢測血清IFN-γ、IL-17含量，在波長450 nm酶標儀上讀取各孔光密度值，以光密度值為縱坐標，標準品濃度作為橫坐標，繪制曲線圖，根據樣品光密度值計算濃度范圍。

1.6.3 大鼠外周血T淋巴細胞亞群 取大鼠外周血100 μL置入流式管底，再各取20 μL APC-CD3抗體、PE-CD4抗體、FITC-CD8抗體置入流式管底，與全血混勻，室溫避光孵育20min。每管加1倍溶血素2 mL，混勻后避光靜置10 min，1 000 r/min離心5 min，半徑10 cm，棄上清，加2 mL PBS洗液重懸細胞，采用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.6.4 大鼠口腔黏膜組織病理變化 大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切取對照組大鼠口腔黏膜組織、造模大鼠口腔黏膜潰瘍組織，體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，生理鹽水沖洗組織塊上黏液、血液，展平后維持原型。4%中性甲醛固定，梯度脫水、浸蠟、包埋，最后切片，厚度為4 μm，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6.5 大鼠口腔黏膜組織MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表達 按試劑盒說明書提取大鼠口腔黏膜組織蛋白，BCA法測定蛋白總量，蛋白與上樣緩沖液混勻后，沸水浴10 min使之變性，冷卻后離心取上清，取60 μg進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，電轉儀電轉60 min，封閉液室溫孵育2 h，加入1∶1 000稀釋的兔抗大鼠β-actin、MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65抗體（一抗），4 ℃搖床過夜，加入1∶10 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，常溫孵育30 min，暗室中曝光、顯影，用凝膠成像系統檢測目的條帶，MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65灰度值與內參β-actin灰度值比值，即為目的蛋白相對表達量，并計算p-NF-κB p65/NF-κB比值。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，計量資料以“均數±標準差”（）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，如Levene檢驗方差齊，采用單因素方差分析，再用LSD-t行兩兩比較，如Levene檢驗方差不齊，改用welch檢驗，再用Dunnett T3檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠口腔潰瘍變化比較 5組大鼠口腔潰瘍數目、潰瘍評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，左旋咪唑組、黃潰瘍合劑低劑量組、知柏潰瘍合劑高劑量組大鼠潰瘍數目減少，潰瘍評分降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低、高劑量組大鼠潰瘍數目增多，潰瘍評分升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組潰瘍數目減少，潰瘍評分降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠口腔潰瘍數目、潰瘍評分比較（）

表2 各組大鼠口腔潰瘍數目、潰瘍評分比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與左旋咪唑組比較，bP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 5組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，pg/mL）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，pg/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05；與左旋咪唑組比較，cP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，dP＜0.05

2.3 大鼠外周血T淋巴細胞亞群比較 5組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+降低（P＜0.05）。（見表4、圖1）

表4 各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群比較（）

表4 各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05；與左旋咪唑組比較，cP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，dP＜0.05

圖1 各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群流式圖

2.4 各組大鼠口腔黏膜組織病理變化 對照組大鼠黏膜上皮完整，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠口腔黏膜組織破潰，細胞核深染、固縮、碎裂，可見大量空泡變性，大量炎癥細胞浸潤；左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜上皮組織基本完整，炎癥細胞浸潤較少；知黃潰瘍合劑低劑量組大鼠炎癥細胞浸潤情況較模型組有所改善，空泡變性減少。（見圖2）

圖2 各組大鼠口腔黏膜組織病理圖（HE，×200）

2.5 各組大鼠口腔黏膜組織MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表達比較 5組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB均升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB均降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB均升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組MCP-1、CCR2蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB均降低（P＜0.05）。（見表5、圖3）

圖3 各組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表達Western blotting 圖

表5 各組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表達情況比較（）

表5 各組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表達情況比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05；與左旋咪唑組比較，cP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，dP＜0.05

3 討 論

復發性口腔黏膜潰瘍又稱“復發性阿弗他潰瘍”，病因復雜，包括精神緊張、局部創傷、飲食、維生素缺乏等。目前現代醫學認為遺傳、免疫、環境因素為其產生發展的重要因素[6]。復發性口腔黏膜潰瘍在中醫學中屬于“口瘡”范疇，主要病機為“火”，中醫提出了諸多中藥方劑，如知黃潰瘍合劑，原方源自《辨證錄》中的“引火湯”，在辨證論治原則指導下調整，作為常用經驗方治療復發性口腔黏膜潰瘍，效果確切，有推廣價值[7-8]。

知黃潰瘍合劑由熟地黃、黃柏、知母、玄參、麥冬、茯苓、巴戟天組成。熟地黃為君藥，滋陰補血；黃柏、知母、麥冬為臣藥，黃柏有解毒斂瘡、瀉火除蒸之功效，專用于濕疹濕瘡、瘡瘍腫毒，知母性寒，可滋陰潤燥，麥冬滋養肺金，金水相生，可輔助熟地黃滋陰；茯苓利水滲濕，巴戟天溫陽除濕，且水火并補，可“引火歸原”。全方共奏溫補腎陽、解毒斂瘡、滋陰瀉火之功效，故適宜用于治療復發性口腔黏膜潰瘍。本研究結果顯示，模型組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠的潰瘍數目依次減少，潰瘍評分依次降低，提示知黃潰瘍合劑有一定治療作用，其中以高劑量知黃潰瘍合劑的效果更佳。復發性口腔黏膜潰瘍創面愈合通常需經歷炎癥、增殖、塑形3個階段，以炎癥為基礎，長期炎癥反應可造成“難愈性創面”[8]。IL-17、IFN-γ為口腔潰瘍產生的主要炎癥因子，IL-17是活化T細胞所產生的促炎性細胞因子，IFN-γ含量與潰瘍病情密切相關[9-11]。本研究結果顯示，與模型組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低，其中知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量更低；HE染色觀察大鼠口腔黏膜病理變化發現，知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠的口腔黏膜上皮組織趨于完整，炎癥細胞浸潤較少，提示知黃潰瘍合劑在復發性口腔黏膜潰瘍治療中有抗炎作用，且高劑量復方潰瘍合劑抗炎功效更突出，更有助于保護口腔黏膜組織完整。免疫因素被認為是復發性口腔黏膜潰瘍發生的主要因素之一，細胞免疫與其發作存在密切關系。T淋巴細胞分為兩類：CD4+T細胞和CD8+T細胞，前者是輔助-誘導亞群，后者是殺傷-抑制亞群，各亞群之間互相調節、平衡，確保機體對外源性抗原刺激產生免疫應答[12-13]。CD4+/CD8+下降可增強機體對各種特異性和非特異性因子的易感性，促進口腔黏膜局部潰瘍發生[14]。謝方英等[15]發現復發性口腔黏膜潰瘍模型大鼠的CD4+/CD8+明顯降低，經治療后升高，本研究結果與其具有一致性，提示高劑量知黃潰瘍合劑在增強復發性口腔黏膜潰瘍大鼠自身免疫能力上的積極作用。

梅和平等[16]研究發現復發性口腔黏膜潰瘍發作后，巨噬細胞異常激活，分泌大量促炎因子，直接損傷口腔黏膜組織，同時還可激活NF-κB抑制蛋白激酶復合體，促使NF-κB移位到細胞核，并結合靶基因啟動區域上NF-κB位點，增強促炎因子IL-17等表達、抑制抗炎因子基因表達，打破抗炎、促炎因子之間平衡，加劇口腔黏膜損傷，反過來再度加速NF-κB擴散及核轉移，形成惡性循環，導致口腔黏膜潰瘍反復發作、纏綿不愈。MCP-1在復發性口腔黏膜潰瘍轉歸中有重要作用，其可在復發性口腔黏膜潰瘍發作時快速結合CCR2，誘導巨噬細胞聚集于口腔、活化，激活炎癥信號通路，增加促炎因子分泌，對口腔黏膜組織造成不可逆性損傷。本實驗中，模型組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表達增強，而知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表達明顯減弱，其中尤以左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠蛋白表達最弱，提示高劑量知黃潰瘍合劑可能通過下調MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表達，發揮對復發性口腔黏膜潰瘍創面的修復作用。

綜上所述，知黃潰瘍合劑可有效修復復發性口腔黏膜潰瘍模型大鼠創面，發揮抗炎、增強免疫的效應，其作用機制可能是抑制MCP-1/CCR2/NF-κB通路。