基于Wnt/β-catenin信號通路益氣活血法對局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用及機制研究

馬小晴，郎豐龍，趙 爽，張 強

（撫順市中心醫院，遼寧 撫順 113006）

缺血性腦血管病多發于中老年人，發病率、致殘率和病死率均較高，如未及時治療，可導致腦組織不可逆損傷，及時治療后患者仍有復發可能，且多數患者留有偏癱、失語等后遺癥，給社會和家庭帶來了沉重負擔[1-2]。臨床上治療缺血性腦血管病主要通過重建血流，恢復缺血區血液供應以減少腦損傷。近年臨床研究發現，缺血性腦組織血管自然再通或經溶栓治療恢復血流后，再灌注的血流可引起一系列級聯反應，從而加重腦組織損傷，導致腦組織缺血再灌注損傷[3]。補陽還五湯是臨床治療缺血性腦血管病常用方劑之一，有益氣活血之功效，血塞通主要成分為三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡等作用[4-5]。補陽還五湯和血塞通用于治療缺血性腦血管病已有文獻報道[6-7]，但兩者合用對于缺血再灌注損傷的報道較少。本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，模擬缺血再灌注損傷導致的腦梗死過程，觀察補陽還五湯聯合血塞通的益氣活血法對局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用，并探討其作用機制，以期為臨床治療缺血性腦血管病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SPF級健康雄性SD大鼠114只，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠購入后于通風環境，溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%，明暗周期12 h/12 h循環，適應性飼養1周。本實驗經撫順市中心醫院醫學實驗動物管理委員會審批通過。

1.2 藥物與試劑 注射用血塞通凍干粉（黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，國藥準字Z20026437，規格：400 mg，批號：20170603）；補陽還五湯煎液（本院自制）；TTC染色液（2%）（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G3005）；兔抗大鼠無翅型MMTV整合位點家族成員3a（wingless-type MMTV integration site family member 3a，Wnt3a）單抗（貨號：ab219412）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）單抗（貨號：ab93926）、β-連環蛋白（β-catenin）單抗（貨號：ab184919）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）單抗（貨號：ab134175）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）多抗（貨號：ab196495）、Bax單抗（貨號：ab182733）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（貨號：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 101-1A烘箱（上海坤天實驗室儀器有限公司）；SLAN-96P/SLAN-96S/48P實時熒光定量PCR儀（上海宏石醫療科技有限公司）；DYCZ-20H型高通量垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 造模與分組 取80只大鼠，禁食不禁水12 h，采用大腦中動脈栓塞法[8]建立局灶性腦缺血再灌注模型。1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定，縱切左側頸部正中部位皮膚暴露頸總動脈，分離頸外和頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端，夾閉頸內動脈、頸總動脈，將線栓自頸總動脈向顱內方向插入，插入深度18～20 mm至出現阻力，結扎線栓切口下方，松開動脈夾。術后大鼠加電熱毯保暖，記錄缺血開始時間，2 h后緩慢拔出線栓，縫合傷口，使用適量抗生素以防感染。另取17只大鼠為假手術組，手術方法同上，僅暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，然后逐層縫合皮膚。剩余17只大鼠為空白組，不做任何處理。

建模成功標準：待大鼠清醒后，參照Longa等[9]的方法對大鼠神經功能缺損進行評分，剔除手術過程中死亡大鼠，神經功能缺損評分2～3分納入實驗。建模成功大鼠共69只，隨機分為模型組17只，血塞通組17只，補陽還五湯組17只、聯合組18只。

1.5 實驗給藥 神經缺損評分完畢后，根據動物與人體等效劑量換算[10]，進行給藥。注射用血塞通凍干粉采用專用溶劑溶解后以5%葡萄糖注射液稀釋至質量濃度為10 mg/mL備用；補陽還五湯方藥組成：黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，用雙蒸水浸泡4 h，水煎2次（加水量分別是藥材質量混度的10倍、8倍，煎煮時間分別為2、1 h），合并煎液濃縮至生藥質量濃度為2 g/mL，pH值調至7.0備用。給藥方法：血塞通組大鼠尾靜脈注射血塞通溶液（50 mg/kg）+灌胃生理鹽水（10 mL/kg）；補陽還五湯組大鼠尾靜脈注射5%葡萄糖注射液（5 mL/kg）+灌胃補陽還五湯煎劑（20 g/kg）；聯合組大鼠尾靜脈注射血塞通溶液（50 mg/kg）+灌胃補陽還五湯煎劑（20 g/kg）；空白組、假手術組和模型組大鼠尾靜脈注射5%葡萄糖注射液（5 mL/kg）+灌胃生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續給藥7 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 神經功能缺損評分 分別于缺血再灌注后1、3、7 d，每次干預后2 h，對各組大鼠進行神經功能缺損評分，評分方法同前。

1.6.2 大腦含水量 末次干預后2 h，每組隨機選取6只大鼠，脫頸處死，斷頭取腦，用濾紙擦干腦組織表面血跡，進行稱重，為腦濕質量，之后110 ℃烘箱中烘干再次稱重，為腦干質量，腦含水量=（腦濕質量-腦干質量）/腦濕質量×100%。

1.6.3 腦梗死體積 末次干預后2 h，每組隨機取6只大鼠，脫頸處死后取腦，去除嗅球和小腦，自額極開始間隔2 mm使用切刀連續切取5張冠狀腦片-20 ℃保存。放入TTC染色液中，37 ℃避光染色，兩面分別染色10～15 min后，4%多聚甲醛中固定過夜。TTC染色后，梗死大腦區域因無法著色呈現白色，正常腦組織呈紅色，觀察拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件測量梗死區域面積，腦梗死體積=腦梗死面積×切片厚度（2 mm），分析腦梗死體積百分比，腦梗死體積百分比=腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.6.4 腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相對表達量 末次干預后2 h，脫頸處死各組剩余大鼠，取腦保存于液氮中。取液氮保存腦組織70 mg，采用Trizol法提取總RNA，檢測樣品RNA濃度和純度，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄cDNA。反應體系：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，雙蒸水7 μL。反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環。以GAPDH為內參基因，按照2-△△CT計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.5 腦組 織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量 取液氮保存腦組織70 mg，冰上裂解，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。100 ℃加熱5 min進行蛋白變性，制備蛋白上樣液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，將膜分別與1:1 000稀釋的Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、Axin2、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4 ℃封閉過夜，洗膜，加入1:4 000稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗，常溫搖床孵育2 h，加入ECL發光液，曝光。采用Image J軟件分析圖像，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以“均數±標準差”（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。重復計量資料比較采用重復測量方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 空白組和假手術組大鼠未見神經功能缺損癥狀。不同再灌注時間（1、3、7 d）之間大鼠神經功能缺損評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在時間效應，4組均如此；模型組大鼠神經功能缺損評分隨著時間延長而升高（P＜0.05），血塞通組、補陽還五湯組和聯合組大鼠神經功能缺損評分隨著時間延長而降低（P＜0.05）。4組大鼠神經功能缺損評分總體比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在分組效應。與模型組比較，血塞通組、補陽還五湯組和聯合組大鼠1、3、7 d神經功能缺損評分均降低（P＜0.05）；聯合組大鼠1、3、7 d神經功能缺損評分均低于血塞通組和補陽還五湯組（P＜0.05）。時間因素與分組因素間存在交互效應（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠神經功能缺損評分比較（，分）

表2 各組大鼠神經功能缺損評分比較（，分）

注：F時間主效應=21.326，P時間主效應=0.000；F分組主效應=52.469，P分組主效應=0.000；F交互效應=18.497，P交互效應=0.000；與模型組比較，aP＜0.05；與血塞通組比較，bP＜0.05；與補陽還五湯組比較，cP＜0.05；與同組內1 d比較，dP＜0.05；與同組內3 d比較，eP＜0.05

2.2 各組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比比較 假手術組大鼠大腦含水量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組和假手術組比較，模型組大鼠大腦含水量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，血塞通組、補陽還五湯組和聯合組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比均明顯降低（P＜0.05）；聯合組大鼠腦梗死體積百分比低于血塞通組和補陽還五湯組（P＜0.05）。（見圖1、表3）

圖1 各組大鼠腦切片TTC 染色

表3 各組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比比較（，%）

表3 各組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比比較（，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與血塞通組比較，dP＜0.05；與補陽還五湯組比較，eP＜0.05

2.3 各組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比較 假手術組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達量和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達量均升高，GSK-3β mRNA相對表達量及Bcl mRNA-2/Bax mRNA均降低（P＜0.05）；與模型組比較，血塞通組、補陽還五湯組和聯合組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，GSK-3β mRNA相對表達量均降低（P＜0.05）；與血塞通組和補陽還五湯組比較，聯合組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，GSK-3β mRNA相對表達量降低（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA 相對表達量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA 比較（）

表4 各組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA 相對表達量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA 比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與血塞通組比較，dP＜0.05；與補陽還五湯組比較，eP＜0.05

2.4 各組大鼠腦組織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax比較 假手術組大鼠腦組織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達量和Bcl-2/Bax與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達量升高，GSK-3β蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）；與模型組比較，血塞通組、補陽還五湯組和聯合組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均升高，GSK-3β蛋白相對表達量均降低（P＜0.05）；與血塞通組、補陽還五湯組比較，聯合組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均升高，GSK-3β蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。（見表5、圖2）

圖2 各組大鼠腦組織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、Bcl-2、Bax 蛋白表達Western blotting 圖

表5 各組大鼠腦組織Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax 比較（）

表5 各組大鼠腦組織Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax 比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與血塞通組比較，dP＜0.05；與補陽還五湯組比較，eP＜0.05

3 討 論

缺血性腦血管病的發病多與血栓形成有關，由于流向大腦的血流供應不足或中斷，引起腦組織局部缺血缺氧，破壞血腦屏障通透性，造成腦組織水腫，最終導致缺血性壞死。缺血性腦血管病目前尚無特效療法，臨床上通常采用溶栓或機械性碎栓進行治療，可有效減輕腦損傷，但由于“時間窗”等因素限制，以及溶栓后血流再灌注容易引起腦出血等并發癥，導致病情惡化，損傷加重[11-12]。本研究成功建立局灶性腦缺血再灌注模型，實驗過程中假手術組各項指標改變與空白組比較無明顯差異，證實造模手術方式對腦組織無明顯損傷。

中醫學認為氣虛血瘀、腦脈阻滯是導致缺血性腦血管病的基本病機，因氣虛而致血瘀，致使經脈瘀塞不通，血流不達于腦部，形成缺血性腦損傷[13]。采用益氣活血法可以從整體上改善和保護缺血引起的腦組織損傷，氣盛而脈絡通，使利腦之氣血供養得以恢復，從而發揮對腦組織的保護作用[14]。補陽還五湯由黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁組成，重用黃芪補氣，兼用少量活血化瘀藥配伍，共奏補氣活血通絡之功效，主治氣虛血瘀之中風。血塞通主要成分為三七提取物，有活血祛瘀、通脈活絡作用，可擴張腦血管、增加血流量，改善缺血受損的腦組織。兩者聯合應用有益氣活血功效，可加強益氣，去除瘀血，調和氣血，消除病因，從而改善患者臨床癥狀，發揮腦保護作用。本研究聯合組大鼠神經功能缺損評分、大腦含水量明顯降低，腦梗死體積明顯減小，提示采用補陽還五湯聯合血塞通的益氣活血法治療缺血再灌注引起的腦損傷，效果明顯。研究發現，益氣活血法可有效減輕小鼠肺缺血再灌注損傷，保護受損肺組織[15]。臨床研究顯示，益氣活血法可明顯改善缺血性腦卒中患者恢復期臨床癥狀及功能缺損，綜合療效顯著[16]。氣虛是中風致病之根源，氣行則血行，氣滯則血滯，益氣則氣行，活血則瘀除。益氣活血，使氣血和暢，則腦府得養，神明自復。

細胞凋亡在缺血再灌注損傷中發揮了重要作用，經典Wnt/β-catenin信號通路參與細胞增殖分化，與缺血再灌注損傷關系密切。Wnt是一個富含半胱氨酸的脂質修飾糖蛋白家族，Wnt3a可促進細胞的分裂、加速分化增殖，是信號通路中重要的激活劑。β-catenin是一種細胞骨架蛋白，參與調節細胞分化、增殖。GSK-3β是β-catenin上游的關鍵酶，通過對β-catenin磷酸化，維持其在細胞內的低表達量。CyclinD1是β-catenin的下游靶基因，是細胞周期增殖信號的關鍵蛋白。無Wnt蛋白存的情況下，GSK-3β可使β-catenin在Axin中磷酸化，通過泛素化的方式被蛋白酶降解；存在Wnt蛋白時，其與受體Fre結合后激活Wnt/β-catenin 信號通路，GSK-3β 被磷酸化而失活，β-catenin的降解途徑被阻斷，導致其在胞漿累積而進入細胞核，激活下游CyclinD1，促進細胞增殖或活化[17]。Bcl-2基因是細胞凋亡的重要基因之一，可以抑制細胞凋亡，Bax為Bcl-2同源基因，促進細胞凋亡，Bcl-2/Bax常用來衡量細胞凋亡情況[18]。本研究結果顯示，聯合組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA及蛋白水平降低，GSK-3β mRNA及蛋白水平升高，Bcl-2/Bax升高，提示Wnt/β-catenin信號通路被激活，可抑制細胞凋亡，促進細胞存活，有利于減輕大鼠腦組織缺血再灌注損傷。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活，可提高心肌細胞存活率，減輕心肌缺血再灌注損傷[19]。另有研究顯示，調節GSK-3β介導的Wnt/β-catenin途徑，誘導細胞抗凋亡促存活，可減輕缺血再灌注引起的肝損傷[20]。Wnt/β-catenin信號通路在缺血再灌注中發揮重要作用，與本研究結果一致，提示Wnt/β-catenin信號通路激活可抑制細胞凋亡，促進細胞存活，有效減輕缺血再灌注引起的腦損傷。

綜上所述，血塞通聯合補陽還五湯的益氣活血法對缺血再灌注大鼠有腦保護作用，其機制可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制細胞凋亡，促進細胞存活，從而減輕缺血再灌注引起的腦損傷，發揮腦保護作用，可為臨床治療缺血性腦血管病提供理論參考。