高效液相色譜法測定透析液中枸櫞酸根含量

曲亞南，徐蘇華，葉曉燕，黃麒諭，柯軍(通信作者)

1 國家藥品監督管理局體外循環器械重點實驗室·廣州市生物醫用血液凈化材料研究與開發重點實驗室 (廣東廣州 510663)；2 廣東省醫療器械質量監督檢驗所包裝材料容器檢驗中心 (廣東廣州 510663)；3 廣東省醫療器械質量監督檢驗所 (廣東廣州 510663)

枸櫞酸鈉是一種抗凝血劑，被臨床用于血液透析中。目前，枸櫞酸抗凝在血液透析中有多種應用方案，其中一種是將枸櫞酸加入透析液中進行體外循環抗凝[1]。檢測該類透析液中枸櫞酸根含量的方法主要參考《中華人民共和國藥典》2020年版四部3108枸櫞酸離子測定法第二法[離子交換高效液相色譜法(ion-exchange high performance liquid chromatography，IEC-HPLC)]與第三法[反相色譜柱鹽洗脫法(reverse phaseyquid chromatography citrate in dialysa，RP-HPLC)][2]。其中，《中華人民共和國藥典》2020年版四部3108枸櫞酸離子測定法第三法中前處理(步驟為取供試品溶液1 ml，精密加1.5%磺基水楊酸4 ml，混勻，于室溫下靜置2 h以上，以3 000 r/min離心10 min，取上清液測定)的目的是除去血液制品中的蛋白質，需要較長時間及稀釋樣品。本研究根據透析液樣品不含蛋白質的實際情況，對《中華人民共和國藥典》2020年版四部3108枸櫞酸離子測定法第三法前處理進行適當優化，即省略加入磺基水楊酸溶液與離心步驟，并進行方法驗證和樣品測定，同時按《中華人民共和國藥典》2020年版四部3108枸櫞酸離子測定法第三法平行測定透析液，驗證兩種測定結果的一致性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀；Sartorius SQP SECURA224-1CN電子天平；廣東立佳實業有限公司LDZF-6020真空干燥箱；梅特勒-托利多S220 pH計；Brand移液器；上海飛鴿TDL-5-A低速臺式離心機；二水合枸櫞酸鈉，SIGMA-ALDRICH，批號LRAC3037，使用前真空60 ℃干燥至恒重；無水磷酸氫二鈉，廣東光華科技股份有限公司，分析純；無水磷酸二氫鈉，廣東光華科技股份有限公司，分析純；異丙醇，天津市大茂化學試劑廠，分析純；磷酸，廣州化學試劑廠，分析純；磺基水楊酸，天津市大茂化學試劑廠，分析純。

1.2 測試樣品

取枸櫞酸根陰性透析液樣品(A)一批及枸櫞酸根陽性透析液樣品(B)一批。

2 優化法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18，4.6 mm×250 mm；進樣量為20 μl；流動相為18.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含18.2 mmol/L無水磷酸二氫鈉、18.2 mmol/L無水磷酸氫二鈉混合溶液和0.1%異丙醇，用磷酸調節pH=2.00)；流速為1 ml/min；波長為210 nm；柱溫箱為40 ℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的二水合枸櫞酸鈉對照品0.5011 g，用水溶解并定容10 ml。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品經0.2 μm濾膜過濾后直接注入高效液相色譜儀。

2.4 加標樣品的制備

取陰性樣品(A)及陽性樣品(B)加入適量枸櫞酸根標準溶液，得到以下加標樣品(表1)。

表1 加標樣品濃度(mg/ml)

2.5 方法學考察

2.5.1系統適用性

將對照品溶液用水稀釋至0.3007 mg/ml，同時取陰性樣品(A)及陽性樣品(B)測定，結果發現，陰性對照溶液在與對照品溶液相同保留時間處無色譜峰(圖1)；系統適用性參數見表2。

表2 系統適用性

2.5.2方法檢出限和方法定量限

取11份檢出限加標樣品經0.2 μm濾膜過濾，檢測待測物峰面積，求出標準偏差，根據公式(方法檢出限=3×S×k/a，方法定量限=10×S×k/a，S為峰面積的標準偏差，k為稀釋倍數，a為標準曲線斜率)求出方法檢出限和方法定量限，見表3。

表3 方法檢出限及方法定量限結果

2.5.3線性范圍

精密量取儲備液適量，用水稀釋制成系列溶液，進樣測定，以濃度為橫坐標，平均峰面積為縱坐標繪制標準曲線(圖2)，結果表明，枸櫞酸根在濃度范圍內的線性關系良好，相關系數R2為0.99998，見表4。

表4 線性關系(n=2)

2.5.4回收率及精密度試驗

取陰性樣品(A)及陽性樣品(B)的加標樣品1～3進行測定，計算得到回收率及精密度，見表5。

表5 回收率和精密度結果

2.6 樣品測定與結果對比

取陽性樣品(B)，分別按《中華人民共和國藥典》2020年版四部3108枸櫞酸離子測定法第三法及其優化法進行測定，結果顯示，兩種方法差異無統計學意義(t=1.587，P>0.05)，見表6。

表6 陽性樣品(B)中枸櫞酸根含量測定結果(mg/ml)

3 討論

3.1 流動相的選擇

由于枸櫞酸在水溶液中很容易電離，產生多峰現象[3]，為了使其盡可能以分子形式存在，流動相pH極為重要。透析液樣品pH一般為7.0～8.0，若直接進樣與流動相混合，較易產生溶劑效應，《中華人民共和國藥典》2020年版四部3108枸櫞酸離子測定法第三法中規定流動相pH為2.0～2.5，本研究嘗試pH 2.25和2.00，發現pH 2.25出現雙峰現象，流動相pH 2.00時枸櫞酸根色譜峰型對稱，故選擇流動相pH 2.00進行試驗。

3.2 結果對比

采用統計學t檢驗對優化法與標準方法測定一批陽性樣品(B)中的枸櫞酸根含量進行比較，得出t=1.587，查t分布表，t0.05,20=2.086，表明優化法與標準方法的結果比較無顯著差異。

總之，本研究建立的檢測方法易于操作、快速、誤差小，可為目前透析液中枸櫞酸根含量測定提供方法學依據。