高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白含量

◎ 鄭仕劍，徐騰洋，焦玉芬，盛華棟

（浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

乳鐵蛋白是一種天然的、具有免疫功能的球狀單體糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員[1]。1939年Sorensen等在動物乳中發(fā)現(xiàn)[2]；1959年Groves用色譜制得純品；1960年Montreuij&Johansonb在人乳中發(fā)現(xiàn)，1961年Blanc和Isliker從人乳中分離獲得并正式命名為乳鐵蛋白[3]。乳鐵蛋白具有殺菌和抑菌[4-5]、抗病毒[6]、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)整腸道菌群、促進(jìn)鐵吸收等功能[7-9]，是一種新興的功能性食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑，常用于嬰幼兒配方食品中。研究表明，人及牛的初乳中乳鐵蛋白含量較高，人乳中乳鐵蛋白含量約占總蛋白含量的22%，而牛乳中不到1%，人乳中乳鐵蛋白含量遠(yuǎn)高于牛乳中[10]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對食品營養(yǎng)要求越來越高，特別是嬰幼兒食品，通過向其添加分離純化的牛初乳乳鐵蛋白，使嬰幼兒配方食品趨向于母乳化。近年來乳鐵蛋白成為了一個熱點，為了更好地研究乳鐵蛋白及其功能，需要建立有效的檢測方法。

目前，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑乳鐵蛋白》（GB 1903.17—2016）中簡單介紹了食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑-乳鐵蛋白占總蛋白含量的檢測方法[11]，《奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定液相色譜法》（T/TDSTIA 006—2019）[12]中介紹了液相色譜法測定奶與奶制品中乳鐵蛋白的含量，但國內(nèi)尚未制定嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，乳鐵蛋白未進(jìn)入檢測體系，每年的食品安全監(jiān)督抽檢并未包含該項檢測，嬰幼兒配方乳粉中常常添加一定量乳鐵蛋白，國外嬰兒配方乳粉中乳鐵蛋白的添加量在50 mg/100 g左右[13]，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB l4880—2012）規(guī)定，嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白最大允許添加量為100 mg/100 g[14]。

檢測方法的匱乏，會影響業(yè)界對嬰幼兒配方乳粉質(zhì)量的判定，不利于嬰幼兒配方乳粉中營養(yǎng)強(qiáng)化添加劑的風(fēng)險監(jiān)督監(jiān)測，因此，急需對嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白的檢測方法進(jìn)行探究，完善我國食品安全管控體系。乳鐵蛋白的測定方法主要有分光光度法[15]、酶聯(lián)免疫吸附法[16-17]、毛細(xì)管電泳法[18]、高效液相色譜法[19-20]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[21]等。分光光度法測定乳鐵蛋白含量時的準(zhǔn)確性較差，酶聯(lián)免疫吸附法和高效毛細(xì)管電泳法的樣品前處理操作比較煩瑣，預(yù)處理時間也較長[22]。相對而言，色譜法的測定準(zhǔn)確性好，肝素免疫親和柱處理后目標(biāo)峰明確，干擾峰少，且具有前處理簡單、用時短等優(yōu)點。

嬰幼兒配方乳粉成分復(fù)雜，有脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)含量高，其中乳鐵蛋白含量低，各種雜蛋白干擾大，且單一儀器往往難以滿足檢測需求，多儀器聯(lián)用是乳鐵蛋白檢測方法建立的研究方向。建立嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白含量測定相應(yīng)的檢測方法，并對不同主流品牌嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行篩查，為嬰幼兒配方乳粉中乳鐵蛋白含量分析提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，為國家出臺相關(guān)檢測方法及添加限量要求提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，北京美正生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），美國默克公司；氯化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，三氟乙酸（均為分析級），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本，島津公司），配備二極管陣列檢測器（DAD）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國，Millipore），HiTrapTMHeparin HP（1mL）肝素親和柱（美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)）；高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.3 溶液的配制

（1）磷酸緩沖鹽A（0.1 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）。稱取磷酸二氫鈉1.92 g，磷酸氫二鈉11.93 g，加適量水溶解，定容至1 L。

（2）磷酸緩沖鹽B（0.1 mol·L-1NaCl，0.05 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）。稱取磷酸二氫鈉0.96 g，磷酸氫二鈉5.96 g，氯化鈉5.84 g，加適量水溶解，定容至1 L。

（3）磷酸緩沖鹽C（1.0 mol·L-1NaCl，0.05 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）。稱取磷酸二氫鈉0.96 g，磷酸氫二鈉5.96 g，氯化鈉58.4 g，加適量水溶解，定容至1 L。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10 mg·mL-1）：稱量按證書提供的純度（99%）換算后的質(zhì)量0.101 0 g，用水定容至10 mL，于-20 ℃保存。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1.0 mg·mL-1）：準(zhǔn)確移取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液500μL，用磷酸緩沖鹽A定容至5 mL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

乳鐵蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取一定量乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用磷酸緩沖鹽A稀釋定容，配制成0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和1.00 mg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 樣品處理方法

稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入30 mL磷酸鹽緩沖液A，渦旋振蕩至全部溶解，再用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5，沉淀酪蛋白，混勻，10 000 r·min-1離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，磷酸鹽緩沖液A定容至刻度，混勻，過水系濾膜，取中間濾液于2 mL進(jìn)樣瓶中待HPLC檢測。

1.6 HPLC色譜條件

色譜柱：HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：100 μL；檢測波長：280 nm；流速：0.5 mL·min-1；流動相梯度洗脫條件：0～3 min磷酸緩沖鹽A（100%），3～7 min磷酸緩沖鹽B（100%），7～22 min磷酸緩沖鹽C（100%），22～30 min磷酸緩沖鹽A（100%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

高效液相色譜法分離嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白常用的色譜柱有大粒徑C4、C8、C18等反相色譜柱，嬰幼兒乳粉成分復(fù)雜，且乳鐵蛋白含量低，各種雜蛋白干擾較大，以上柱子常常不能將乳鐵蛋白與其他雜蛋白進(jìn)行有效分離，且需要用到肝素親和柱進(jìn)行前處理凈化提純。本文提出將肝素親和柱直接作為色譜柱，凈化分離乳鐵蛋白，DAD檢測。肝素親和柱是分離糖基化蛋白質(zhì)的常用凈化柱。肝素親和柱中的配體主要是硫酸化糖胺聚糖，肝素由交互的糖醛酸和D-葡糖胺單位組成，且被一個或兩個硫酸基團(tuán)取代，肝素可作為親和配體，和乳鐵蛋白相互作用，具有高選擇性。因此，選擇肝素親和柱，可以使乳鐵蛋白特異性地與其結(jié)合，其他雜蛋白由于不與肝素親和柱結(jié)合，保留時間短，流出色譜柱時間較早，與乳鐵蛋白分離開。使用肝素親和柱作為色譜柱，可以減少前處理凈化過程，提高檢測效率，且液相色譜自動進(jìn)樣，程序洗脫，穩(wěn)定性好。標(biāo)樣譜圖見圖1，樣品譜圖見表2。

圖1 乳鐵蛋白溶液（0.5 mg·mL-1）高效液相色譜圖

2.1.2 流動相條件的選擇

在pH為5～10時，肝素親和柱都是穩(wěn)定的，選用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液作為緩沖溶液，在進(jìn)樣前，用5～10倍柱體積的此緩沖溶液（流動相A）平衡柱子。根據(jù)乳鐵蛋白和肝素親和柱的結(jié)合特性，肝素具有大量陰離子的硫酸基團(tuán)，可以增加離子強(qiáng)度把乳鐵蛋白從親和柱上洗脫下來。因此在流動相B中加入少量NaCl，淋洗色譜柱，梯度洗脫，逐漸增加NaCl濃度（流動相C），最終把乳鐵蛋白洗脫下來。

2.1.3 進(jìn)樣體積、檢測波長及流速的確定

我國嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白最大允許添加量為100 mg/100 g，含量較低，因此為提高信號響應(yīng)，選擇進(jìn)樣100 μL。

使用紫外分光光度計對乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)其在波長220 nm、280 nm處有較強(qiáng)的吸收，但在波長220 nm時，基線不平穩(wěn)，噪聲較大，而在280nm時，基線噪聲較小，靈敏度高，因此選擇280 nm作為檢測波長。

肝素親和柱較短，適宜流速為0.1～1.0 mL·min-1，流速太小，出峰慢，會增加分析時間，同時峰形會變寬；流速太大，目標(biāo)物質(zhì)還沒與干擾物質(zhì)分離開就被洗脫下來。在流速0.5 mL·min-1時，峰形尖銳，干擾小，因此選擇0.5 mL·min-1的流速。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

嬰幼兒乳粉中蛋白種類繁多，成分復(fù)雜，蛋白相互之間干擾大，且酪蛋白占80%以上，為了盡可能得到較干凈的樣品，采用50%甲醇法沉淀，磷酸調(diào)pH沉淀，硫酸鋅沉淀法進(jìn)行試驗，除去乳粉中以酪蛋白為主的雜質(zhì)蛋白。結(jié)果表明，甲醇沉淀和硫酸鋅鹽析沉淀樣品，回收率在75%，回收率差，而用磷酸鹽提取后，磷酸調(diào)pH至4.5，離心過膜上機(jī)，能有效除去酪蛋白，回收率達(dá)95%，見圖2。

圖2 兩種前處理方法的回收率圖

該方法操作簡單，且提取液中成分與流動相中磷酸鹽緩沖液基本一致，降低提取液對流動相的干擾，故選用磷酸調(diào)pH法作為前處理凈化方法。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

吸取不同濃度乳鐵蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100 μL，在上述色譜條件下，經(jīng)HPLC測定，保留時間19.169 min，峰形尖銳，基線較平穩(wěn)。

以峰面積y為縱坐標(biāo)，乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，乳鐵蛋白線性回歸方程為y=2 546 380x-640.579，相關(guān)系數(shù)0.999 98，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3，結(jié)果顯示，在0.01～1.00 mg·mL-1，所得峰面積與濃度的線性關(guān)系較良好。

圖3 乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

方法學(xué)中檢出限（LOD）和定量限（LOQ）由信噪比（S/N）計算得出，檢出限（S/N=3）為0.1 mg/100 g，定量限（S/N=10）為0.3 mg/100 g

2.4 方法的加標(biāo)回收率

在空白奶粉中添加不同濃度的乳鐵蛋白，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，分別進(jìn)行6平行試驗，加標(biāo)回收率89.9%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.61%～4.00%，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度加標(biāo)回收率結(jié)果表

2.5 精密度及重現(xiàn)性試驗

取同一市售嬰幼兒乳粉，按1.5中的方法進(jìn)行樣品處理，按1.6中的色譜條件進(jìn)行檢測，做6次平行試驗，結(jié)果6次測定的平均值為44.9 mg/100 g，范圍 為42.4～47.2 mg/100 g，RSD為3.85%；對 同 一市售嬰幼兒乳粉，換不同操作人員，做6次重復(fù)試驗，結(jié)果6次測定的平均值為45.1 mg/100 g，范圍為42.9～46.9 mg/100 g，RSD為3.21%，見表2。結(jié)果表明，該方法精密度較高，重現(xiàn)性較好。

表2 同一奶粉6次平行實驗結(jié)果和重現(xiàn)性測試結(jié)果表

2.6 實際樣品的檢測

對市場上不同品牌嬰幼兒乳粉進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表3。

表3 市場上嬰幼兒乳粉中乳糖蛋白的測定結(jié)果表

不同品牌的嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白的含量各不相同，營養(yǎng)成分表中顯示添加外源性乳鐵蛋白的乳粉有檢出，而營養(yǎng)成分表中未標(biāo)注添加外源性乳鐵蛋白的乳粉都未檢出。

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜串聯(lián)肝素親和柱對嬰幼兒乳粉中乳鐵蛋白含量進(jìn)行檢出，首次提出將肝素親和柱應(yīng)用到乳鐵蛋白上機(jī)分析中，優(yōu)化之后，試樣中的乳鐵蛋白經(jīng)磷酸緩沖鹽A（0.1 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖鹽）提取，過膜上機(jī)，經(jīng)HiTrapTMHeparin HP 1 mL規(guī)格的親和柱分離，二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。方法平均加標(biāo)回收率在89.9%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.61%～4.00%，定性檢測限（LOD）是0.1 mg/100 g，定量檢測限（LOQ）是0.3 mg/100 g。本方法與文獻(xiàn)中報道的方法比較，具有前處理操作簡單，快速，檢測成本低，可大批量上機(jī)檢測，重復(fù)好，靈敏度高等優(yōu)勢，能滿足目前乳粉中乳鐵蛋白含量的檢測，為國家出臺相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)及添加限量要求提供技術(shù)支持。