兩株產紅色素細菌的分離、鑒定及培養條件初步研究

◎ 徐姍娜，盧 軍，侯鴻飛，趙蕓卉

（漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000）

食品在制作過程中，經常會使用食用色素這一食品添加劑，以滿足食品的感官要求。而食用色素又分為人工合成色素和天然色素。由于大多數人工合成色素被發現對人體有害，而天然色素不僅安全性高，還具有一定的藥用價值和保健功能，在食品、化妝品、保健品等行業領域具有巨大的的開發價值和應用前景。目前，世界各國尤其是發達國家都在加強對人工合成色素的使用進行規范和限制，并加大對天然色素的開發、研究和利用[1]。而我國由于對天然色素的研發起步較晚，還沒有達到發達國家以天然色素使用為主、人工合成色素使用為輔的程度。

食品用天然色素根據來源可分為植物色素、動物色素和微生物色素。目前，從動、植物色素中已研發出的種類較多，但價格昂貴。微生物色素多數是細菌、放線菌等的次級代謝產物，而微生物又具有易培養、生長繁殖快的特點，使得較低成本的工業生產獲得此類色素成為可能。當前，已知的色素產生菌主要有假單胞菌屬、微球菌屬、紅曲霉和沙雷氏菌屬[2]等。而粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）正是重要的天然紅色素——靈菌紅素(Prodigiosin，PG)的主要生產菌株。

近日，本實驗室在對兩批次食物樣品進行大腸菌群計數時，在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）平板上發現若干顏色鮮紅的菌落，這與在VRBA上呈紫紅色菌落，且周圍有紅色膽鹽沉淀環的大腸菌群明顯不同。挑取可疑菌落進行劃線分離，得到的菌株分別編號為WSW801和WSW851，使用全自動微生物鑒定系統進行菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株WSW801、菌株WSW851。

1.2 培養基與試劑

營養瓊脂（NA）培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養基，革蘭氏染色試劑為北京陸橋技術股份有限公司產品。

1.3 儀器

光學顯微鏡Ci-L（尼康儀器有限公司）、全自動微生物鑒定系統WalkAway-40 plus（貝克曼庫爾特商貿有限公司）。

1.4 菌株鑒定方法

對菌株WSW801和菌株WSW851分別進行革蘭氏染色鏡檢，結果顯示二者皆為革蘭氏陰性菌。采用Prompt快速接種法，菌株WSW801和菌株WSW851分別使用貝克曼專用取菌針沾取菌落3次，用環狀蓋帽將針邊緣多余的細菌刮掉，將取菌針插入專用的30 mL Prompt接種水瓶中，徹底混勻。依次接種于革蘭氏陰性菌鑒定板Neg Combo 50中，貼標簽，放板，開始培養、鑒定，探究不同條件下WSW801和WSW851中靈菌紅素的產生情況。

2 結果與分析

為研究不同培養溫度對WSW801和WSW851中靈菌紅素產生的影響，選用NA瓊脂和VRBA瓊脂兩種培養基，將菌株WSW801和WSW851分別在28 ℃、36 ℃和42 ℃溫度下培養24～48 h，在24 h和48 h觀察靈菌紅素產生的情況，結果見表1。在NA瓊脂培養基上，兩種菌株在不同溫度條件下培養24 h后色素的產生情況見圖1、圖2。

圖1 菌株WSW801在不同溫度下培養24 h后色素產生情況圖

圖2 菌株WSW851在不同溫度下培養24 h后色素產生情況圖

表1 不同培養溫度、培養基、培養時間對靈菌紅素產生的影響表

結果表明，菌株WSW801和菌株WSW851經鑒定均為粘質沙雷氏菌。測定不同培養溫度、培養基、培養時間對WSW801和WSW851中靈菌紅素產生的影響，發現二者均能在28 ℃和36 ℃培養時產生靈菌紅素，且28 ℃培養時產色素更多，而在42 ℃培養時均不產生靈菌紅素；相同溫度、相同時間培養時NA瓊脂上的色素產量比VRBA瓊脂更多；培養時間從24 h延長至48 h時，靈菌紅素產生量并無明顯變化。

3 討論

粘質沙雷氏菌在自然界分布較廣，可存在于土壤、水，植物和動物等的腸道和呼吸道中，屬于變形菌門腸桿菌科下的沙雷菌屬，革蘭氏陰性兼性厭氧菌，短桿菌可近球形，無莢膜，形態上比其他腸道菌小，為細菌中最小者。沙雷氏菌所產紅色素是研究較多的一類微生物天然紅色素，稱為靈菌紅素。靈菌紅素作為粘質沙雷氏菌的次級代謝產物，是一類含甲氧基吡咯骨架結構的天然紅色素，相較于營養性低、有毒副作用的人工合成色素具有色調自然、使用安全等特點和優勢，有研究發現，靈菌紅素可能具有抗真菌、抗細菌等作用，因此，研究其在食品、功能性保健食品等色素添加劑工業中的應用具有較大的前景和價值[2]。

微生物相較動、植物雖然生長旺、繁殖快、易培養、適應性強，但通過微生物生產色素的條件卻較為復雜，不同的碳源、氮源選擇、培養溫度和pH等條件對不同菌株產色素的成分及產量會有不同的影響，另外，培養基中的磷酸鹽、金屬離子、溶解氧等也會或多或少對次級代謝產物產生影響。粘質沙雷氏菌對生存溫度的要求范圍較為寬泛，但靈菌紅素的合成對溫度的要求卻較為嚴格[3]，此外，不同光照、氮源[4]、培養pH[5]對靈菌紅素的合成都會產生一定的影響。

本次試驗結果顯示，粘質沙雷氏菌WSW801和WSW851在28 ℃和36 ℃培養時均能產生靈菌紅素，且28 ℃培養時產色素更多，而在42 ℃培養時不產生靈菌紅素，與前人研究認為的粘質沙雷氏菌產色素最適溫度范圍為25～35 ℃相吻合[6]。不同培養基、培養時間對WSW801和WSW851中靈菌紅素產生的影響結果顯示，選用營養瓊脂培養基更有利于該菌產生靈菌紅素，而時間24 h對于該菌產生色素已經足夠，不需再延長至48 h。

4 結論

天然色素雖具有多方面的優勢，但作為次級代謝產物，本身大多是分子結構比較復雜的化合物，穩定性較差，如pH、光照、氧化劑、儲存溫度和食品中其他添加劑等都有可能影響天然色素的穩定性，使其發生顏色變化、褪色甚至色素損失。綜上所述，為微生物生產天然色素選擇最優的培養條件，使得天然色素更高產，探索天然色素的最佳貯存條件，提高天然色素的穩定性，是利用研究、開發天然色素在食品、保健食品、化妝品工業等領域的使用亟待解決的兩大問題。