黑糌粑功效成分花青素及抗氧化性的分析

◎ 扎西窮達，曹葉偉，朱肖翔，次仁卓嘎，尼 珍

（西藏自治區食品藥品檢驗研究院，西藏 拉薩 850000）

黑糌粑是用黑青稞炒熟后磨成粉狀，是西藏傳統特色食品，黑糌粑營養豐富，風味獨特[1]。目前，對黑糌粑的分析研究主要集中在對其中基礎營養成分的測定研究，而對關鍵功能特性和功能物質，特別是對一些顏色較深的黑糌粑中花青素總量等研究報道很少，本研究中選取與黑糌粑功能及作用相關的重要理化指標進行分析，為黑糌粑的品質分析提供參考依據。

黑糌粑作為藏區人們食用的重要主食之一，能為食用者提供能量，還能提供提高免疫力等作用的功能因子[2]，因此，針對黑糌粑具有降血脂、降血糖、抗氧化和抗癌等輔助功效，分別選取花青素含量、抗氧化性指標進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

拉薩堆龍古榮黑糌粑（7批）、山南隆子加玉黑糌粑（6批），共13批。

1.2 試劑

超純水、Tris-HCl、鄰苯三酚、磷酸緩沖液、過氧化氫、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、十二水合硫酸鐵銨、鹽酸、正丁醇、乙醇，除另有說明外，所有試劑均為分析純；原花青素標準對照品（純度＞98%）；甲酸、甲醇、乙腈為色譜純。

1.3 儀器

液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器；TU-1810D紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Scilogex MX-S渦旋混合器；電子天平，感量為0.000 1 g；離心機，轉速可達8 000 r·min-1以上；超低溫冰箱，（-80±5）℃；超聲波清洗器，40 kHz；旋轉蒸發儀，帶有溫度控制；控溫磁力攪拌器，帶有溫度控制。

1.4 方法

1.4.1 樣品中總花青素的含量

（1）溶液的配制。標準溶液：稱取原花青素對照品1.5 mg，甲醇溶解稀釋至5 mL，制成0.3 mg·mL-1原花青素標準溶液。2.0%硫酸鐵銨溶液：精密稱取硫酸鐵銨0.20 g，加2 mol·L-1鹽酸溶液溶解并稀釋至10 mL，搖勻。5%鹽酸/正丁醇溶液：于100 mL容量瓶中加入約2/3的正丁醇，精密加入鹽酸5.0 mL，用正丁醇溶解至刻度。

（2）測定。①標準曲線的制作：分別精密吸取原花青素標準溶液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL和1.50 mL至10 mL比色管中，分別加甲醇2.90 mL、2.75 mL、2.50 mL、2.00 mL和1.50 mL，搖勻（定容到3 mL）。分別吸取上述溶液1 mL，加入6 mL的5%鹽酸/正丁醇溶液、0.2 mL的2.0%硫酸鐵銨溶液至具塞試管中，于沸水浴中加熱40 min，冰浴冷卻15 min；用1 mL甲醇、6 mL 5%鹽酸/正丁醇溶液和0.2 mL的2.0%硫酸鐵銨溶液做空白，于546 nm波長處測定吸光度值。②試樣制備。稱樣品充分混勻后取2.0 g于15 mL離心管中，加10.0 mL甲醇，攪拌均勻后離心，取上清液0.5 mL用甲醇稀釋至10 mL制成樣品待測液。③試樣中原花青素含量的測定。取樣品待測液1.0 mL，加入6 mL的5%鹽酸/正丁醇溶液、0.2 mL的2.0%硫酸鐵銨溶液至具塞試管中，于沸水浴中加熱40 min，冰浴冷卻15 min，分別測定其吸光度值，以空白試劑調零，根據式（1）計算樣品中原花青素的含量[3]。

式中：Xi-試樣中被測組分含量，mg·g-1；Ci-被測組分濃度，mg·mL-1；V-定容體積，mL；f-稀釋倍數；M-樣品質量，g。

（3）儀器條件。紫外分光光度計，波長為546 nm。

1.4.2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量

（1）溶液的配制。單一組分標準溶液：準確稱取標準品各5.0 mg，甲醇定容至10 mL，配制成500 mg·L-1標準儲備液，-18 ℃以下貯存，備用。混合標準溶液：根據各種黃酮類物質在儀器上的響應值，逐一吸取一定單一體積標準溶液配制成混合標準溶液，再稀釋成不同質量濃度的混合標準溶液，用于制作標準工作曲線，混合標準溶液現用現配。

（2）測定。稱取2 g試樣（精確到0.01 g）于50.0 mL棕色離心管中，加入約5 mL 80%乙醇溶液，混合，室溫下超聲30 min，3 500 r·min-1離心5 min，上清液轉入10 mL棕色容量瓶中，殘渣再用約5 mL 80%乙醇溶液按上述步驟重復提取1次，合并2次提取液，用80%乙醇溶液定容至10.0 mL，準確吸取10 mL提取液于50 mL旋轉蒸發瓶中，35 ℃下減壓蒸發除去乙醇，濃縮至約3 mL。C18固相萃取小柱依次用約5 mL甲醇和約5 mL水預淋洗、活化后，將樣品提取濃縮液加至小柱中，旋轉蒸發瓶用5 mL水清洗，清洗液轉入小柱中，抽濾，棄除濾液。再用約8 mL甲醇分別清洗兩次，清洗液加入到小柱中，收集濾液，甲醇定容至10.0 mL，過濾膜，待測定[4]。

（3）儀器條件。高效液相色譜法配二極管陣列；檢測波長：520 nm；色譜柱：C18色譜柱，柱長250 mm，內徑4.6 mm，顆粒度5 μm；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10 μL；流動相：流動相A：20%甲酸；流動相B：100%乙腈。洗脫梯度條件見表1。

表1 洗脫梯度表

1.4.3 水溶物抗氧化性

（1）樣品處理。精確稱取黑糌粑粉2.0 g于離心管中，加入20 mL超純水，渦旋混勻，超聲提取30 min，渦旋混勻，放入離心機中3 500 r·min-1離心10 min，得上層清液為樣品溶液。

（2）超氧陰離子自由基測定。取4.5 mL 0.05 mol·L-1、pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液于試管中，置25 ℃水浴中預熱20 min，按順序加入0.1 mL樣品，0.4 mL 2.5 mmol·L-1鄰苯三酚，混勻后在25 ℃水浴中準確反應4 min，立即用8 mol·L-1的鹽酸2滴中止反應，測定波長299 nm處的吸光值，記為A測定。以0.1 mL蒸餾水代替樣品，按同樣方法測定吸光度，記為A對照[5]，根據式（2）計算：

（3）羥自由基測定。按順序分別在試管中加入1 mL 0.15 mol·L-1、pH 7.4的磷酸緩沖液，0.5 mL樣品，1 mL 1.3%過氧化氫（新鮮配制），1 mL 0.95 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉（新鮮配制），混合后在30 ℃水浴中反應30 min后，在波長550 nm處測吸收度，記為C測定。空白以0.5 mL蒸餾水代替樣品，按同樣方法測定吸光度，記為C對照[6]，根據式（3）計算：

（4）儀器條件。紫外分光光度計；波長：299 nm、550 nm。

2 結果與分析

2.1 總花青素含量結果與分析

2.1.1 總花青素含量結果

黑糌粑具有獨特的黑紫色，這主要與其中含有花青素密切相關。花青素也是黑糌粑抗氧化、去除自由基功能的重要基礎物質，分析黑糌粑中的花青素總量，對了解和評價黑糌粑功能特性具有重要的參考作用。對13批黑糌粑樣品已原花青素計，總花青素含量結果見表2。

表2 黑糌粑總花青素含量表

2.1.2 總花青素含量分析

通過對黑糌粑樣品中總花青素數據分析表明，總花青素含量為0.451～0.916 mg·g-1，大部分集中在0.5～0.7 mg·g-1，其中山南隆子加玉黑糌粑3總花青素含量最高，拉薩堆龍古榮黑糌粑6含量最低。按不同產地比較，山南隆子加玉黑糌粑的花青素含量普遍高于拉薩堆龍古榮黑糌粑（見圖1），不同產地的黑糌粑中總原花青素含量相差較大，這可能與種植環境、青稞種類及土壤等有一定的影響。

圖1 黑糌粑中總花青素含量圖

2.2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量結果和分析

2.2.1 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量結果

花青素，是自然界一類廣泛存在于植物中的天然色素，已知花青素有20多種，食物中重要的有6種左右[7]。黑糌粑中花青素主要存在的形式為矢車菊素及其葡萄糖糖苷。對黑糌粑花青素種類矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量結果見表3。矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品及黑糌粑樣品色譜圖見圖2。

圖2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品及黑糌粑樣品色譜圖

表3 黑糌粑花青素種類及含量表

2.2.2 矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量分析

通過表3發現，矢車菊素含量為0.034 4～0.046 7 mg·g-1，含量最高的樣品是山南隆子加玉黑糌粑3；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量在0.008 6～0.0166 mg·g-1，含量最高的樣品還是山南隆子加玉黑糌粑3，這與總花青素含量最高結果一致，也表明黑糌粑花青素主要以矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷存在，與抗氧化能力等正相關。一些樣品中矢車菊素與其糖苷含量較低，說明這些樣品中游離形式的花青素含量低，可能與樣品的產地和加工方法相關。

2.3 水溶物抗氧化性含量結果與分析

2.3.1 水溶物抗氧化性含量結果

黑糌粑中含有一定量的抗氧化物質。氧化反應和脂質過氧化反應積極參與人體正常的生理生化反應和免疫反應，保持機體內正常的氧化還原電勢以及在人體的新陳代謝中起著重要作用。因此，研究和評價物質的抗氧化活性，有利于促進人體的健康和多種疾病的預防與調控。

羥基自由基和超氧陰離子自由基是人體中能夠產生的重要自由基，對人體健康具有重要影響[8]，通過分析黑糌粑中水溶性物質對這些自由基的抑制和清除效果，對了解不同種類黑糌粑產品的功能特性具有重要的參考價值。選取兩批拉薩堆龍古榮黑糌粑和兩批山南隆子加玉黑糌粑進行測定，結果見表4。

表4 黑糌粑水溶物抗氧化性表（單位：%）

2.3.2 水溶物抗氧化性含量分析

通過對4批黑糌粑樣品中水溶性物質抑制人體代謝中可產生的羥自由基和超氧陰離子自由基能力的數據分析，結果表明，黑糌粑對羥自由基抑制率達到56.36%～89.34%，其中山南隆子加玉黑糌粑3抑制羥自由基的能力最強，幾種黑糌粑對羥自由基的抑制效果均比較明顯；黑糌粑對超氧陰離子自由基的抑制率達到52.95%～55.45%，其中拉薩堆龍古榮黑糌粑1對超氧陰離子自由基的抑制能力最好，但所有樣品對超氧陰離子的抑制率均低于0.15 mg·mL-1Vc標準品溶液。

3 結論

黑糌粑中含有水溶性花青素、其他多酚類物質、超氧化物歧化酶等抗氧化、去除自由基的活性物質。若自由基產生過多或清除過慢，積累濃度過高時，會造成機體損傷，加速機體衰老并誘發各種疾病，如癌癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等。黑糌粑中這些活性物質能通過清除機體自由基的方式降低各種疾病的發生率。

黑糌粑中呈現特有的黑紫色物質，主要是含有花青素有密切關系，其中黑糌粑中花青素主要由矢車菊素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷形式存在，這些物質其主要作用抗氧化，有效的自由基清除率。通過黑糌粑功效成分及作用分析，花青素含量為0.451～0.916 mg·g-1，大部分集中在0.5～0.7 mg·g-1；其中花青素種類中矢車菊素含量為0.034 4～0.046 7 mg·g-1，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量在0.008 6～0.016 6 mg·g-1；黑糌粑對羥自由基抑制率達到56.36%～89.34%，對超氧陰離子自由基的抑制率達到52.95%～55.45%。

通過對黑糌粑一些關鍵特征指標進行分析檢測，結果表明，山南隆子加玉黑糌粑3含量高于其他樣品，且這些指標含量分布有一定的高低，這可能與原料生產產地環境、加工條件都有一定關系，也對不同產地樣品之間功能特性和作用等狀況進行了解、評價；為黑糌粑產品的品質、功能特性的分析、監測等提供重要的思路和參考方法。